PCR的基本原理和概念
PCR的基本原(yuan)理和概念
1983年美國PE-Cetus公司的Mullis等人發明了聚合酶鏈反應(polymerase chain re action,PCR),1985年公開報道,使人們能在試管內以幾小時的反應將擴增10^9倍.1987年PCR得到美國的專利權,PCR技術在生命科學中掀起了一場革命,并形成了巨大的市場,有人預言,本世紀末PCR產值可達到4x10^8美元.本章介紹PCR的原理、常用的各種PCR方法及主要應用范圍.
一、基本原理
DNA在細胞中的復制是—個比較復雜的過程.參與復制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA連接酶、DNA、由引發酶合成的RNA、核苷酸原料、無機離子、合適的pH、以及解開DNA的超螺旋及雙螺旋等結構的若干酶與因子等.
PCR是在試管中進行DNA復制反應,基本原理與體內相似,不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶,用合成的DNA引物替代RNA引物,用加熱(變性)、冷卻(退火、保溫(延伸)等改變溫度的辦法使DNA得以復制,反復進行變性、退火、延伸循環,就可使DNA無限擴增.PCR的具體過程如下：
將PCR反應體系升溫至95℃左右,雙鏈的DNA模板就解開成兩條單鏈,此過程為變性.然后將溫度降至引物的Km值以下,3'端與5'端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補區域結合,此過程稱為退火.當將反應體系的溫度升至70℃左右時,耐熱的Taq DNA聚合酶催化四種脫氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互補方式依次加至引物的3'端,形成新生的DNA鏈.每一次循環使反應體系中的DNA分子數增加約一倍.理論上循環幾次,就增加為2^n倍.當經30次循環后,DNA產量達2^30拷貝,約為10^9個拷貝.PCR擴增過程見圖8-1.由于實際上擴增效率達不到2倍,因而應為（1+R）^n,R為擴增效率.
二、參與PCR反應體系的因素及其作用
參與PCR反應的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、緩沖液、Mg2+、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、反應溫度與循環次數、PCR儀等.現對它們的作用介紹如下：
(一)模板核酸
用于PCR的模板核酸可以是DNA,也可以是RNA.當用RNA作模板時,首先要進行反轉錄生成cDNA,然后再進行正常的PCR循環.核酸模板來源廣泛,可以從培養細胞、、、組織、病理標本、考古標本等中提取.
PCR反應時加入的DNA模板量一般為拷貝,現在的技術水平已能從單個細胞制備出相應的cDNA文庫.DNA模板含量合適,可以減少PCR多次循環帶來的堿基錯配.
通常模板DNA用線性DNA分子,若為環狀質粒,最好先用酶將其切開成線狀分子,因為環狀DNA復性太快.
(二)引物
引物決定PCR擴增產物的特異性與長度.因此,引物設計決定PCR反應的成敗.
PCR反應中有兩種引物,即5'端引物與3'端引物.5'端引物是指與模板5'端序列相同的寡核苷酸,3'端引物是指與模板3'端序列互補的寡核苷酸.對引物的基本要求有：①引物的長度過短會影響PCR的特異性,要求有16-30bp,因為4^16=4.29x10^9,已大于3x10^9bp,保證了特異性結合；引物過長使延伸溫度超過Taq DNA聚合酶的最適溫度(74度),亦會影響產物的特異性.②G+C的含量一般為40％-60％.③四種堿基應隨機分布,不要有連續3個以上的相同嘌吟或嘧啶存在.尤其是引物3'端,不應有連續3個G或c,否則會使引物與核酸的G或c富集區錯誤互補,而影響PCR的特異性.④引物自身不應存在互補序列而引起自身折疊,起碼引物自身連續互補堿基不能大于3bp.⑤兩引物之間不應互補,尤其是它們的3'端不應互補.一對引物之間不應多于4個連續堿基有互補性,以免產生引物二聚體.④引物與非特異靶區之間的同源性不要超過70％或有連續8個互補堿基同源,否則導致非特異性擴增.①引物3'端是引發延伸的點.因此不應錯配.由于ATCG引起錯配有一定規律,以引物3'端A影響最大,因此,盡量避免在引物3'端第一位堿基是A.引物3'端也不要是編碼密碼子的第三個堿基,以免因為密碼子第3位簡并性而影響擴增特異性.⑧引物5'端可以修飾,包括加酶切位點,用生物素、熒光物質、地高辛等標記,引入位點,引入序列,引入蛋白質結合DNA序列等,引物的設計最好以電腦軟件進行指導.
反應體系中,引物濃度一般要求在O.1-0.5μmol之間.濃度太高,容易生成引物二聚體,或非特異性產物.
引物Tm值與退火溫度有關,計算公式為：Tm=4(G+C)+2(A+T).引物Tm值最好在55-80℃范圍,以接近72℃為最好.
(三)耐熱的TaqDNA聚合酶
1976年Chien分離出熱穩定聚合酶,1986年Erlich分離并純化了適于PCR的Tq熱穩定性聚合酶,為PCR成為實用技術奠定了基礎,現已用基因重組生產.日前可用于PCR的聚合酶有多種：有從水生棲熱菌中提取的Taq酶、從嗜熱棲熱苗中獲得的Taq酶、從Litoralis棲熱球菌中分離的VENT酶、及從酸熱浴硫化裂片苗中分離的Sac酶,而以Taq酶用得最廣泛.Taq DNA聚合酶分子量為94kD,75℃時酶比活性為150bs/酶分子,反應溫度過高或過低均影響其延伸率,Taq蕾有很高的耐熱穩定性.實驗表明,在92.5℃、95℃、97.5℃時,其半衰期分別為40min、30min和5min.
純化的Taq酶在體外無3'-5'外切酶活性,因而無校正閱讀功能,在擴增過程可引起錯配.錯配堿基的數量受溫度、Mg2+濃度和循環次數的影響.通常,30次循環Taq酶的錯配率約為0.25％,高于Klenow酶的錯配率.Taq酶在每一次循環中產生的移碼突變率為1/30000,堿基替換率為1/8000.應用低濃度的dNTP(各20μmol／L)、1.5mmol/L的Mg2+濃度、高于55℃的復性溫度,可提高Taq酶的忠實性,此時的平均錯配率僅為5x10^-6次/（核苷酸*循環）.
Taq酶具有類似于末端轉移酶的TdT的活性,可在新生成的雙鏈產物的3'端加上—個堿基,尤其是dATP最容易加上.因此,欲將PCR產物克隆到載體上,可以用兩種處理辦法：一是構建dT-載體；二是用Klenow酶將3'端的A去掉,即在PCR反應后,先在99℃加熱10min滅活Taq酶,調整Mg2+濃度至5-10mmol/L,加入1-2U Klenow片段,室溫下作用15-20min,3'端的A即被切去,
Taq酶還具有反轉錄活性.在2-3mmol/L Mg2+濃度下68℃時出現類似反轉錄酶的活性.若有Mg2+存在,則反轉錄活性更佳,利用這一活性,可直接用于RNA-PCR,尤其是短片段的擴增.
以往用Taq酶進行PCR擴增,一般只能擴增小于400bp的DNA片段,經過對酶的結構與功能的改造,以及PCR方法學的改進,現已能擴增20kb以上的DNA分于.
Taq酶在PCR反應中加入的量也很重要,太少當然不好,太多一方面浪費,同時也導致非特異性擴增,通常每lOOμl反應液中含1-2.5U Taq酶為好.最好在0.5-5U范圍內確定最佳酶濃度.另一個問題是,雖然Taq酶是熱穩定性較好的工具酶,也應注意在-20℃貯存.
(四)緩沖液
緩沖液提供PCR反應合適的酸堿度與某些離子,常用10-50mmol/L.Tris-HCI(pH8.3-8.8)緩沖液.緩沖液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火.有人并加入小牛血清白蛋白(100μg/L)或明膠(0.0％)或Twen20(0.05％-0.1％)或二硫基蘇糖醇(DDT,5mmol/L)等,認為這些物質可以保護Taq酶.
(五)Mg2+
Taq酶的活性需要Mg2+.Mg2+濃度過低,Taq酶活力顯暑降低；Mg2+濃度過高,又使酶催化非特異性擴增.Mg2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR產物的解鏈溫度、引物二聚體的生成等.Taq酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關,而PCR反應體系中,dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基團均可與Mg2+結合而降低Mg2+的游離濃度.因此,Mg2+的總量應比dNTP的濃度高0.2-0.25mmol/L.如果反應體系中含有EDTA等螯合劑,也可結合掉一部分Mg2+.
為了獲得Mg2+的最佳濃度,可用下面的優化法.首先在PCR緩沖液小不加入Mg2+,從配置的10mmol/L的Mg2+儲存液中取一定量加入到各反應管中,開始以0.5mmol/L的濃度梯度遞增(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L),由PCR反應后的電泳結果可確定Mg2+大概濃度范圍,再在該濃度的上下以0.2mmol/L遞增與遞減幾個濃度來精確確定Mg2+最適濃度.
(六)dNTP
dNTP為PCR反應的合成原料.每種dNTP濃度應相等,通常的濃度范圍為20-200mol/L,在此范圍內,PCR產物的量、反應的特異性與忠實性之間的平衡最佳.例如,當每種dNTP為20μmol/L時,理論上可以產生2.6μg的400bp的DNA.使四種dNTP的濃度保持在其Km值(10-15μmol/L)以上,可保持堿基摻入的忠實性；若dNTP的濃度大于50mmol/L,則可抑制Taq酶的活性.
(七)反應溫度和循環次數
1．變性溫度與時間
PCR反應中變性這一步很重要,若不能使模板DNA和PCR產物完全變性,PCR反應就不能成功,DNA分子中G+C含量愈多,要求的變性溫度愈高.太高的變性溫度和時間又會影響Taq酶的活性,通常的變性溫度和時間分別為95℃、30s,有時用97℃、15s.雖然DNA鏈在變性溫度時兩鏈分離只需幾秒鐘,但反應管內部達到所需溫度還需要一定的時間,團此要適當延長時間.為了保證模板DNA能徹底變性．最好為7-10min,然后在以后的循環中,將變性步驟設為95℃/min.
擴增100-300bp短片段時,還呵以用快速的兩步PCR法,即變性(94-97℃)、退火及延長(55-75℃).
為防止在變性溫度時反應液的蒸發,可在反應管內加入1-2滴液體石蠟.
2．復性溫度和時間
復性溫度決定PCR的特異性,合適的復性溫度應低于引物Tm值的5℃.退火溫度過低,引起非特異性擴增；增高退火溫度,可提高擴增的特異性,因此要嚴格規定退火溫度.退火反應時間一般為1min.
在PCR開始的頭一次循環時,反應從遠低于Tm值的溫度開溫,由于Taq酶在低溫時仍具有活性,這時就可能因引物與模板非特異性配對面出現非特異性產物或出現引物二聚體 然后在以后整個PCR反應中,非特異性產物反復擴增,而使PCR嚴重失敗.為了盡量消除這種非特異性擴增,可以使用熱起動的方式,熱起動方法有幾種：一種方法是在PCR系統中加入抗Taq酶.抗體與Taq酶結合,使Taq酶活性受抑制.因此在開始時,雖然溫度低,引物可與與模板錯配,但因Taq酶沒有活性,不會引起非特異性擴增；當進行熱變性時,抗體在高溫時失活,Taq酶被釋放,就可發揮作用,在以后的延伸步驟進行特
異的DNA聚合反應.另一種熱起動法是用石蠟將Taq酶與PCR反應系統分隔,因此一開始在室溫條件下也沒有非特異性擴增.當升溫到熱變性溫度下,石蠟熔化,Taq酶與PCR反面系統混合,從而在以后的步驟中發揮作用.使用熱起動可以提高PCR擴增的特異性.
3．延伸溫度與時間
延伸溫度一般為72℃左右,此時Taq酶活性為每秒鐘摻入核苷酸35-100個,2kb的片段用1min已足夠,若DNA片段較長,擴增時間可適當延長.延伸時間過長又可引起非特異性擴增.
4．循環次數
循環次數主要取決于最初靶分子的濃度,例如在初始靶分子為3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷貝數時,循環數可分別為25-30、30-35、35-40從40-45.過多的循環次數會增加非特異性產物量及堿基錯配數.PCR反應后期,擴增產物的增加并不成為指數方式,稱為平臺效應.平臺效應可能與下列因素有關：dNTP與引物濃度降低,酶對模板的比例相對降低,多次循環后酶活力降低,產物濃度增高后變性不完全而影響引物延伸.
(八)PCR儀
有多種進口與國產PCR儀.儀器的升降溫方式可有氣體加溫、水加溫及電熱塊加溫等.溫度、循環次數及時間等參數現多用電腦控制.可根據需要選擇儀器.
由于PCR方法高度靈敏,少量的靶分子即可擴增至無限數.因此要防止PCR擴增產物污染環境而引起以后的PCR假陽性.為此,應將PCR儀及PCR產物檢測等過程與標本制備及PCR反應管的制備盡量在空間分開,最好在不同的房間進行.通常可將實驗空間分為標本處理區、反應混合制備和PCR擴增區、產物分析區等.
PCR標準反應體系
原文地址://www.seekbio.com/biotech/exp/bioexp/2007/3491.html
10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul
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