附件3：
體外診斷(duan)試劑生(sheng)產及質量控制技術(shu)指導原則
——核酸檢測試劑(ji)生產及質量(liang)控制技術指導原則
（征求意見稿）
核(he)(he)酸(suan)(suan)擴增檢(jian)測(ce)(ce)技術(shu)(shu)(shu)泛指(zhi)以擴增DNA或RNA為(wei)手段，從而篩查特定(ding)(ding)基(ji)因的(de)檢(jian)測(ce)(ce)技術(shu)(shu)(shu)，如聚合酶(mei)鏈反(fan)應（PCR）、連(lian)接酶(mei)鏈反(fan)應（LCR）、轉錄(lu)依賴(lai)的(de)擴增反(fan)應（TMA）等。核(he)(he)酸(suan)(suan)檢(jian)測(ce)(ce)試劑(ji)是(shi)基(ji)于核(he)(he)酸(suan)(suan)擴增檢(jian)測(ce)(ce)技術(shu)(shu)(shu)的(de)體外診(zhen)斷試劑(ji)，目前已經(jing)用于病(bing)原體檢(jian)測(ce)(ce)、特定(ding)(ding)疾(ji)病(bing)的(de)早(zao)期診(zhen)斷和體內物質(zhi)的(de)型別鑒(jian)定(ding)(ding)等不(bu)同領域。為(wei)規范核(he)(he)酸(suan)(suan)檢(jian)測(ce)(ce)試劑(ji)的(de)生產(chan)及質(zhi)量控(kong)制，特制定(ding)(ding)本技術(shu)(shu)(shu)指(zhi)導(dao)原則，并將(jiang)根(gen)據核(he)(he)酸(suan)(suan)檢(jian)測(ce)(ce)技術(shu)(shu)(shu)的(de)發(fa)展(zhan)狀況適時(shi)進(jin)行修改。
一、基本要求
1、核酸(suan)類檢(jian)測試(shi)劑(ji)的生產企(qi)業(ye)應獲得《醫療(liao)器械生產許可證(zheng)》。
2、核酸類檢測(ce)試劑(ji)的(de)(de)生產企業應(ying)(ying)具有與其技術要(yao)求相適應(ying)(ying)的(de)(de)人員、環境、設(she)施(shi)和儀器設(she)備(bei)等條件(jian)，建(jian)立專用實(shi)驗室，配備(bei)滿足核酸提取和擴(kuo)增(zeng)檢測(ce)以(yi)及(ji)操作人員防護所需的(de)(de)設(she)備(bei)。實(shi)驗室應(ying)(ying)當(dang)嚴格分區，人員和物(wu)品應(ying)(ying)當(dang)單向流動(dong)，以(yi)最大(da)限度地(di)防止實(shi)驗過程中樣(yang)品之(zhi)間的(de)(de)污染(ran)和避免擴(kuo)增(zeng)產物(wu)的(de)(de)污染(ran)。
3、核酸類檢測試(shi)劑的(de)生(sheng)產企(qi)業應按照《體(ti)外(wai)診斷試(shi)劑生(sheng)產實施細則(ze)（試(shi)行）》的(de)要(yao)求，建立相(xiang)應的(de)質量管理(li)體(ti)系，并應通過《體(ti)外(wai)診斷試(shi)劑生(sheng)產企(qi)業質量管理(li)體(ti)系考核評定(ding)標準(zhun)（試(shi)行）》的(de)考核。
4、核(he)酸類檢測(ce)(ce)試(shi)劑的(de)生(sheng)產(chan)單位應當對(dui)試(shi)劑的(de)使用范圍作出明(ming)確(que)規(gui)定(ding)，并經國家藥品管理部(bu)門(men)批準(zhun)。引物設計(ji)應當符合核(he)酸檢測(ce)(ce)設計(ji)的(de)要求，擴增體系應設定(ding)合理的(de)內標(biao)和外標(biao)，試(shi)劑須設置(zhi)抗污(wu)染(ran)的(de)特定(ding)措施，擴增產(chan)物須進(jin)行確(que)證研究(jiu)。
5、核(he)酸類(lei)檢(jian)測試劑的原材料應制(zhi)訂相(xiang)關質量標(biao)準，應符合(he)現行(xing)《中(zhong)國藥典(dian)》或《中(zhong)國生物制(zhi)品主要原輔料質控標(biao)準》的要求。使用未列(lie)入(ru)上述標(biao)準的化學試劑，應不低(di)于分析純。
二、原材料
應提供(gong)主要原(yuan)材料(liao)(liao)如引(yin)物、探針、企業參考(kao)品(pin)或標(biao)準品(pin)等(deng)的(de)(de)選擇與來(lai)源(yuan)、制(zhi)備過程、質(zhi)量(liang)分析和質(zhi)量(liang)標(biao)準等(deng)的(de)(de)相(xiang)(xiang)關研究資(zi)料(liao)(liao)。如果主要原(yuan)材料(liao)(liao)來(lai)自市場(chang)（從其他單位(wei)購買），應提供(gong)的(de)(de)資(zi)料(liao)(liao)包括：對物料(liao)(liao)供(gong)應商審核的(de)(de)相(xiang)(xiang)關資(zi)料(liao)(liao)、購買合同、供(gong)貨(huo)方(fang)提供(gong)的(de)(de)質(zhi)量(liang)標(biao)準、出(chu)廠檢(jian)定報(bao)告(gao)，以及該原(yuan)材料(liao)(liao)到貨(huo)后(hou)的(de)(de)質(zhi)量(liang)檢(jian)驗(yan)資(zi)料(liao)(liao)。
核酸(suan)類檢(jian)測試劑(ji)的包裝材(cai)料和(he)耗材(cai)應無(wu)DNase和(he)RNase污(wu)染。
1、dNTP
脫氧三磷酸核苷，核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應為HPLC純、PCR級(ji)，無DNase和RNase污(wu)染。-20℃保存。
2、引物
由一定數(shu)量的核苷酸構(gou)成(cheng)(cheng)的特定序列，通常采用DNA合(he)成(cheng)(cheng)儀人(ren)工合(he)成(cheng)(cheng)，合(he)成(cheng)(cheng)后經聚丙烯酰(xian)胺凝膠電(dian)泳或其(qi)他適(shi)宜方法純(chun)化。
凍干粉，1800D以(yi)上。序(xu)列(lie)正確。純度應(ying)達(da)到電泳(yong)級（PAGE）或HPLC級，不含雜帶(dai)。應(ying)提供合(he)成機構出具(ju)的(de)合(he)成產(chan)物的(de)質檢證明，如PAGE電泳(yong)結(jie)果(guo)或HPLC分析圖譜。
應作HPLC分(fen)析和紫外光吸(xi)收分(fen)析。以(yi)紫外分(fen)光光度(du)計(ji)測定OD260nm/OD280nm的比(bi)值在1.6~2.0之間，可視為(wei)合格引物。-20℃保存(cun)。
3、探針
是指特(te)定的帶(dai)有示蹤物(wu)（標記(ji)(ji)物(wu)）的已知核酸(suan)(suan)片段（寡聚核苷酸(suan)(suan)片段），能與(yu)互補(bu)核酸(suan)(suan)序(xu)列退火雜交，用(yong)于特(te)定核酸(suan)(suan)序(xu)列的探(tan)測。通常采(cai)用(yong)DNA合(he)成儀人工(gong)合(he)成，合(he)成后經(jing)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他(ta)適宜(yi)方法純化，在5'-端標記(ji)(ji)熒(ying)光(guang)(guang)素報(bao)告(gao)基團或其他(ta)發光(guang)(guang)標記(ji)(ji)物(wu)，在3'-端標記(ji)(ji)熒(ying)光(guang)(guang)素淬(cui)滅(mie)基團，并經(jing)HPLC或其他(ta)適宜(yi)方法純化。
凍(dong)干(gan)粉，90D以上。純度應(ying)達到HPLC純，不含雜帶。應(ying)提供合成(cheng)機構(gou)出具的(de)(de)(de)合成(cheng)產物(wu)(wu)的(de)(de)(de)質檢(jian)證明(ming)，如(ru)HPLC分(fen)析圖譜；應(ying)對探針的(de)(de)(de)核(he)酸序列及標記(ji)的(de)(de)(de)熒(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)素(su)或化學發光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)物(wu)(wu)進(jin)行核(he)實，并作HPLC分(fen)析。應(ying)以可見—紫外分(fen)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)度計(ji)進(jin)行200~800nm掃描，在(zai)(zai)(zai)(zai)260nm處應(ying)有(you)吸(xi)收(shou)(shou)(shou)峰(feng)(feng)。另外，根(gen)據標記(ji)的(de)(de)(de)熒(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)素(su)的(de)(de)(de)不同，還應(ying)該在(zai)(zai)(zai)(zai)熒(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)素(su)的(de)(de)(de)激發波長處有(you)吸(xi)收(shou)(shou)(shou)峰(feng)(feng)，如(ru)FAM熒(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)素(su)在(zai)(zai)(zai)(zai)494nm、TET熒(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)素(su)在(zai)(zai)(zai)(zai)521nm、TAMRA熒(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)素(su)在(zai)(zai)(zai)(zai)560nm處有(you)特(te)異(yi)的(de)(de)(de)吸(xi)收(shou)(shou)(shou)峰(feng)(feng)，雜交探針在(zai)(zai)(zai)(zai)493nm、625nm、685nm處有(you)特(te)異(yi)的(de)(de)(de)吸(xi)收(shou)(shou)(shou)峰(feng)(feng)，檢(jian)定合格后入(ru)庫(ku)。避光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)、-20℃保存(cun)。
4、Taq DNA聚合酶
具有DNA聚合酶活性(xing)，無核(he)酸(suan)外切酶活性(xing)及(ji)核(he)酸(suan)內(nei)切酶活性(xing)；具熱穩(wen)定性(xing)，94℃保溫1小時后仍保持50%活性(xing)。-20℃保存。
5、UNG（尿嘧(mi)啶糖(tang)基化(hua)酶）
具有尿嘧(mi)啶糖基化(hua)酶(mei)活性(xing)，無核酸(suan)外切酶(mei)及核酸(suan)內(nei)切酶(mei)活性(xing)，IU UNG在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模(mo)版應(ying)完全(quan)降解，不能產生擴增產物。-20℃保存。
6、RT-PCR酶(mei)（反(fan)轉錄擴增酶(mei)）
具(ju)逆轉錄酶(mei)(mei)活性(xing)(xing)和DNA聚合酶(mei)(mei)活性(xing)(xing)，無(wu)核酸(suan)外切(qie)酶(mei)(mei)及(ji)核酸(suan)內(nei)切(qie)酶(mei)(mei)活性(xing)(xing)；具(ju)熱穩定性(xing)(xing)，94℃1小時后仍(reng)保持50%活性(xing)(xing)，-20℃保存。
三、生產工藝
核(he)酸類檢測試劑(ji)的(de)基本生產工(gong)藝通常包括：配制工(gong)作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工(gong)作液的(de)各種原材(cai)料及其配比應(ying)符(fu)合要(yao)求，原材(cai)料應(ying)混合均勻，配制過程應(ying)對pH、電導率等關鍵
參數進行有效控制。
工藝研究的(de)資料(liao)應能對(dui)反應體系涉及到的(de)基本內容如樣(yang)本類(lei)型、樣(yang)本用(yong)量、試(shi)劑用(yong)量、反應條(tiao)件、校(xiao)準(zhun)方法、質控方法、
臨(lin)界值的確(que)定、穩定性和(he)有(you)效期，提供確(que)切的依據。
四、質量控制
（一）半(ban)成品質量控制
1、按批號抽取規定數量(liang)的半成品。
2、以參考(kao)(kao)品(pin)(pin)／對照(zhao)品(pin)(pin)進行半成(cheng)品(pin)(pin)質量控制。如果(guo)產品(pin)(pin)具有國(guo)家標準品(pin)(pin)或參考(kao)(kao)品(pin)(pin)，應以其進行檢定。如果(guo)產品(pin)(pin)不具有國(guo)家標準品(pin)(pin)或參考(kao)(kao)品(pin)(pin)，應根據規定制備(bei)相應的(de)參考(kao)(kao)品(pin)(pin)，或以經(jing)標化的(de)質
粒進行半成品檢定。
3、半成品檢(jian)定內容(rong)包括：對照(zhao)品符合率、靈敏度、特異性、
精密度。結果應符合要求(qiu)。
4、半成(cheng)品(pin)檢定合格后(hou)，按試劑盒組成(cheng)及時進行分裝(zhuang)和包裝(zhuang)。
（二）成品質量控制
1、產(chan)品完(wan)成(cheng)包裝后，應根據生產(chan)量進(jin)行(xing)抽樣和生產(chan)記錄審(shen)
核。
2、以參考品／對照品或(huo)參考品，或(huo)以經標化的質粒(li)進行成(cheng)
品質(zhi)量檢驗。結果應(ying)符合要(yao)求(qiu)。
3、成品(pin)檢(jian)驗(yan)的(de)內容(rong)應包括：對照品(pin)符合率、靈敏(min)度、特異(yi)性、精(jing)密度、線(xian)性和穩(wen)定(ding)性。穩(wen)定(ding)性試驗(yan)可(ke)采用加速破壞試驗(yan)。
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