腫瘤個體化(hua)用藥(yao)相關基因突變檢測試劑
技術審查指導原則（征(zheng)求意見稿(gao)）
本(ben)指導原則(ze)旨在(zai)指導注(zhu)冊申(shen)請人對(dui)腫(zhong)瘤個體化用(yong)藥相(xiang)關基因突變檢測試劑注(zhu)冊申(shen)報(bao)資(zi)料的(de)準備及撰(zhuan)寫，同時也為技術審(shen)評部門對(dui)注(zhu)冊申(shen)報(bao)資(zi)料的(de)技術審(shen)評提(ti)供參(can)考。
本指導(dao)原則是針對腫瘤個體(ti)化用(yong)藥相關基(ji)因(yin)突(tu)變檢測試劑的(de)一般要求，申請人(ren)應依據產(chan)品的(de)具(ju)體(ti)特性確定其中(zhong)內(nei)容是否適用(yong)，若(ruo)不適用(yong)，需具(ju)體(ti)闡述理(li)由及相應的(de)科學依據，并依據產(chan)品的(de)具(ju)體(ti)特性對注冊申報資料的(de)內(nei)容進行充實和細化。
本指導(dao)原則(ze)(ze)是對(dui)(dui)申請人和審查(cha)人員(yuan)的指導(dao)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行(xing)政(zheng)事項，亦不作為法規(gui)強制執行(xing)，如(ru)果有能夠滿足相關法規(gui)要求的其他方(fang)法，也可以采用(yong)，但需要詳(xiang)(xiang)細(xi)闡明(ming)理由，并對(dui)(dui)其科(ke)學合理性進(jin)行(xing)驗證，提供詳(xiang)(xiang)細(xi)的研(yan)究資料和驗證資料，相關人員(yuan)應在(zai)遵循相關法規(gui)的前提下使用(yong)本指導(dao)原則(ze)(ze)。
本指(zhi)導原則(ze)是在現行(xing)法(fa)規和標準(zhun)體系以及當(dang)前認知水平(ping)下制定的(de)，隨著法(fa)規和標準(zhun)的(de)不(bu)斷(duan)完善，以及科學(xue)技術的(de)不(bu)斷(duan)發展(zhan)，本指(zhi)導原則(ze)相關(guan)內容也將(jiang)適時進行(xing)調整。
本文所述腫(zhong)瘤(liu)個體(ti)化(hua)用藥(yao)(yao)相(xiang)關基因突(tu)變(bian)檢測(ce)試劑是指(zhi)利用熒光探(tan)針聚合酶鏈式反應（PCR）方法，以個體(ti)化(hua)用藥(yao)(yao)相(xiang)關的(de)腫(zhong)瘤(liu)突(tu)變(bian)基因為檢測(ce)目(mu)標，對人體(ti)樣本（包括組(zu)(zu)織(zhi)、體(ti)液等）提取的(de)核酸組(zu)(zu)分中的(de)目(mu)標序(xu)列進行體(ti)外檢測(ce)的(de)試劑。
本文所指基因(yin)(yin)突(tu)變(bian)(bian)的(de)類型包括置換、插(cha)入(ru)、缺(que)失、基因(yin)(yin)重排(pai)、拷貝數異(yi)常及RNA表達異(yi)常等廣義(yi)的(de)基因(yin)(yin)突(tu)變(bian)(bian)。
本文所涉及(ji)試劑的方(fang)法學不包括熒(ying)光原(yuan)位雜交(jiao)（Fluorescence in situ Hybridization，FISH）、核酸序列測(ce)定(ding)、染色體(ti)核型分析及(ji)免疫組化(hua)技術(shu)等(deng)(deng)用于(yu)腫瘤個(ge)體(ti)化(hua)用藥(yao)指(zhi)導的其(qi)他(ta)方(fang)法學；本文提出的相(xiang)關要(yao)求(qiu)亦不完全適(shi)用于(yu)PCR熔(rong)解曲線、Luminex平臺或(huo)核酸檢測(ce)芯片等(deng)(deng)其(qi)他(ta)分子(zi)生(sheng)物學技術(shu)，但有利之處可以參考執行。本指(zhi)導原(yuan)則(ze)適(shi)用于(yu)進行首(shou)次注冊申報(bao)和(he)相(xiang)關許可事項變(bian)更的產品。
綜述(shu)資(zi)料主(zhu)要包括產(chan)(chan)(chan)品預(yu)期(qi)用(yong)途(tu)、產(chan)(chan)(chan)品描述(shu)、有關生(sheng)物(wu)安全性的說明、研究結果的總結評價以及同類(lei)產(chan)(chan)(chan)品上市情(qing)況介(jie)紹等內(nei)容，其(qi)中同類(lei)產(chan)(chan)(chan)品上市情(qing)況介(jie)紹部分應(ying)著重從方(fang)法學及不同腫(zhong)瘤突變類(lei)型檢出能(neng)力等方(fang)面寫明擬申報產(chan)(chan)(chan)品與目前市場上已獲批(pi)準(zhun)的同類(lei)產(chan)(chan)(chan)品之間(jian)的主(zhu)要區別。若尚(shang)無同品種批(pi)準(zhun)上市，則應(ying)詳(xiang)細論(lun)述(shu)作為檢測靶(ba)標(biao)的突變基因與個(ge)體化用(yong)藥(yao)的相關性，說明理(li)論(lun)依據。
提交的(de)資(zi)料應符(fu)合《體外診(zhen)(zhen)斷試劑(ji)注(zhu)冊(ce)管理辦(ban)法（試行）》（國(guo)食藥監械〔2007〕229號）（以(yi)下(xia)簡稱(cheng)《辦(ban)法》）和《體外診(zhen)(zhen)斷試劑(ji)注(zhu)冊(ce)申報資(zi)料基本要求》（國(guo)食藥監械〔2007〕609號）的(de)相關要求。
說(shuo)明(ming)(ming)書(shu)(shu)承載了(le)產(chan)品(pin)(pin)預(yu)期(qi)用(yong)途、標(biao)本采集及處理、實驗(yan)方法、檢測結果解(jie)釋以(yi)及注(zhu)意事項(xiang)等(deng)重(zhong)要信(xin)息(xi)，是指導實驗(yan)室工作人員正確(que)操(cao)作、臨床(chuang)醫(yi)生針對檢驗(yan)結果給出合理醫(yi)學解(jie)釋的(de)(de)(de)重(zhong)要依據，因此(ci)，產(chan)品(pin)(pin)說(shuo)明(ming)(ming)書(shu)(shu)是體外(wai)診(zhen)斷試(shi)劑(ji)注(zhu)冊申(shen)報最(zui)重(zhong)要的(de)(de)(de)文(wen)(wen)(wen)件之一。產(chan)品(pin)(pin)說(shuo)明(ming)(ming)書(shu)(shu)的(de)(de)(de)格(ge)式(shi)(shi)(shi)應(ying)符(fu)合《體外(wai)診(zhen)斷試(shi)劑(ji)說(shuo)明(ming)(ming)書(shu)(shu)編(bian)寫指導原則》的(de)(de)(de)要求(qiu)，境外(wai)試(shi)劑(ji)的(de)(de)(de)中(zhong)文(wen)(wen)(wen)說(shuo)明(ming)(ming)書(shu)(shu)除格(ge)式(shi)(shi)(shi)要求(qiu)外(wai)，其內(nei)容(rong)應(ying)盡量保(bao)持與原文(wen)(wen)(wen)說(shuo)明(ming)(ming)書(shu)(shu)的(de)(de)(de)一致性，翻譯力求(qiu)準確(que)且(qie)符(fu)合中(zhong)文(wen)(wen)(wen)表達習慣。產(chan)品(pin)(pin)說(shuo)明(ming)(ming)書(shu)(shu)的(de)(de)(de)所(suo)有(you)內(nei)容(rong)均(jun)應(ying)與申(shen)請人提交的(de)(de)(de)注(zhu)冊申(shen)報資料中(zhong)的(de)(de)(de)相關(guan)(guan)研究結果保(bao)持一致，如某些內(nei)容(rong)引用(yong)自(zi)參考文(wen)(wen)(wen)獻，則應(ying)以(yi)規范(fan)格(ge)式(shi)(shi)(shi)對此(ci)內(nei)容(rong)進(jin)行標(biao)注(zhu)，并(bing)單獨列明(ming)(ming)文(wen)(wen)(wen)獻的(de)(de)(de)相關(guan)(guan)信(xin)息(xi)。
結合《體(ti)外診(zhen)斷試劑說明(ming)書編寫指導原(yuan)則》的要求，下面(mian)對腫瘤個體(ti)化用藥相關基因突變檢測(ce)試劑說明(ming)書的重點內(nei)容進行(xing)詳細說明(ming)，以(yi)指導注(zhu)冊申報人員更(geng)合理地完(wan)成說明(ming)書編制。
1. 【預期用途】
應至少(shao)包括(kuo)以下幾部分內容：
（1） 臨(lin)床(chuang)(chuang)背(bei)景的(de)(de)介紹，包括相關(guan)適(shi)用人群特征、腫(zhong)(zhong)瘤的(de)(de)組織類型、適(shi)用的(de)(de)樣本類型、待(dai)測靶基因序(xu)列的(de)(de)特征及選擇依據，靶基因及其表達蛋白(bai)在惡性腫(zhong)(zhong)瘤發(fa)生、發(fa)展過程中(zhong)可(ke)能起(qi)到(dao)的(de)(de)作用，相關(guan)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)及其作用機理，以及藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)與待(dai)測突(tu)變位點可(ke)能存(cun)在的(de)(de)關(guan)系等。如無合理的(de)(de)臨(lin)床(chuang)(chuang)驗(yan)證，不建議在此涉及具體藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)產品(pin)（商(shang)品(pin)）名稱(cheng)、生產企業等信(xin)息；若有相關(guan)臨(lin)床(chuang)(chuang)驗(yan)證，可(ke)在此明(ming)確具體藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)，但需在說明(ming)書(shu)中(zhong)對相關(guan)的(de)(de)臨(lin)床(chuang)(chuang)研究情況(kuang)進(jin)行簡介。
（2） 試劑盒(he)用于特(te)定(ding)腫瘤(liu)患者人群，通過檢測人體(ti)樣本提取的(de)(de)(de)核酸組分中是(shi)否存在靶基因(yin)突(tu)變，對(dui)臨(lin)床(chuang)上特(te)定(ding)腫瘤(liu)患者的(de)(de)(de)個體(ti)化用藥(yao)提供參考(kao)意見。腫瘤(liu)的(de)(de)(de)類(lei)別及(ji)適用樣本類(lei)型應結合實際的(de)(de)(de)臨(lin)床(chuang)研究完成情況進行確(que)認(ren)。
（3） 明確(que)說(shuo)明該試劑(ji)盒(he)僅用于對特定(ding)腫瘤(liu)患(huan)者靶基因序列的檢(jian)測(ce)，其檢(jian)測(ce)結(jie)果(guo)僅供臨床參考，不應(ying)作為患(huan)者個體(ti)化治(zhi)療(liao)的唯(wei)一依據，臨床醫生應(ying)結(jie)合患(huan)者病(bing)情、藥物適應(ying)癥、治(zhi)療(liao)反應(ying)及其它實(shi)驗(yan)室檢(jian)測(ce)指標等因素(su)對檢(jian)測(ce)結(jie)果(guo)進行(xing)綜合判斷。
2. 【檢(jian)驗原理】
（1） 對試劑盒(he)檢(jian)測(ce)能夠(gou)覆蓋(gai)的所有(you)突(tu)變位點或突(tu)變類(lei)型進(jin)(jin)行詳細描(miao)述（靶序列長度、基(ji)因座位、突(tu)變類(lei)型及相關特征等(deng)），對引物(wu)及探(tan)針設計、不同樣(yang)品反應(ying)管組合(he)、對照(zhao)品設置及熒光信(xin)號(hao)檢(jian)測(ce)原理等(deng)進(jin)(jin)行逐(zhu)項介紹。
（2） 核酸提取方法、原(yuan)理等。
（3） 試劑盒技(ji)術(shu)原理(li)的(de)詳細介紹(shao)，建議結合(he)適當圖(tu)示進行(xing)說明(ming)。如(ru)反應體系中添加了相關的(de)防污染組分(fen)（如(ru)UDG酶(mei)），也應對(dui)其作用機(ji)理(li)作適當介紹(shao)。
3. 【主要組(zu)成成份】
（1） 詳(xiang)細說明試劑盒內各(ge)組分的名稱、數量、內容物(wu)、比例或(huo)濃度、穩定性(xing)(xing)等信息，陰性(xing)(xing)/陽(yang)性(xing)(xing)對照品（或(huo)質控品）可能含有生物(wu)源性(xing)(xing)物(wu)質的組分，應說明其生物(wu)學來源、活性(xing)(xing)及其他(ta)特(te)性(xing)(xing)；說明不同(tong)批(pi)號試劑盒中各(ge)組分是否(fou)可以(yi)互換。
（2） 試劑盒中不包含但對(dui)該項檢測必(bi)須(xu)的組分，企(qi)業應列出相關(guan)試劑/耗材(cai)的名稱(cheng)、注冊證(zheng)號（如有）及(ji)其(qi)他必(bi)要的信(xin)息。
（3） 如(ru)果(guo)試(shi)劑(ji)盒中不包含用(yong)于核酸(suan)分(fen)離/純化(hua)的(de)(de)試(shi)劑(ji)組分(fen)，則應在(zai)此注明(ming)經驗(yan)證后推薦配(pei)合使(shi)用(yong)的(de)(de)商品化(hua)核酸(suan)分(fen)離/純化(hua)試(shi)劑(ji)盒的(de)(de)生產企業、產品名(ming)稱以(yi)及該產品的(de)(de)醫(yi)療器械注冊證號等(deng)詳細信息(xi)。
4. 【儲(chu)存條件及(ji)有效期】
試劑盒的效期（實時）穩(wen)定(ding)性、開瓶穩(wen)定(ding)性、復(fu)溶(rong)穩(wen)定(ding)性、運(yun)輸(shu)穩(wen)定(ding)性、凍融次數要求等(deng)。
5. 【適用儀器】
所有(you)適用的(de)儀(yi)器型號(hao)，并提供與儀(yi)器有(you)關的(de)重要信息以指導用戶操作(zuo)。
6. 【樣本(ben)要(yao)求】
重(zhong)點明確以下內容：
（1） 對適用的樣(yang)本類型作詳細介紹，包括樣(yang)本來源(yuan)及取材要求、樣(yang)本處理(li)方式（如(ru)組織樣(yang)本的固定及包埋方式）、腫瘤細胞比例(li)等。
樣本的(de)取材(cai)及處理(li)方式等若有通用的(de)技術規范或(huo)指南，則應遵循，并在此處引用。
（2） 樣本(ben)處(chu)(chu)理及(ji)(ji)保存(cun)：核酸提(ti)取前樣本(ben)的(de)預(yu)處(chu)(chu)理、保存(cun)條件及(ji)(ji)期限（短期、長期）、運輸條件等。
（3） 在提(ti)取過程結(jie)束后，立(li)即采用適當方法（如分光光度(du)(du)(du)計法）對(dui)提(ti)取后的(de)(de)核酸(suan)儲備(bei)(bei)液(ye)進行濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)確(que)定(ding)，并依據性能驗證(zheng)結(jie)果在此給出用于(yu)擴增(zeng)試(shi)驗的(de)(de)核酸(suan)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)要求。舉例：擴增(zeng)反應(ying)(ying)終(zhong)(zhong)體(ti)系(xi)(xi)中需要50ng的(de)(de)DNA量，而在終(zhong)(zhong)體(ti)系(xi)(xi)中需加入25μl的(de)(de)DNA儲備(bei)(bei)液(ye)，則(ze)在DNA提(ti)取完成(cheng)后應(ying)(ying)將DNA儲備(bei)(bei)液(ye)的(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)調(diao)整至2ng/μl的(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)。
注：基于試劑盒分析(xi)靈敏度(du)(du)的考慮，應對提取后(hou)的核(he)酸儲備液的核(he)酸濃度(du)(du)設定低(di)限要(yao)求，如提取后(hou)的核(he)酸儲備液濃度(du)(du)低(di)于其低(di)限要(yao)求，應擴(kuo)大樣本量重新進(jin)行(xing)核(he)酸的提取。
（4） 操作過程中(zhong)各(ge)種制(zhi)備液的穩定性要求，如各(ge)類混合液（Mix）、DNA/RNA儲(chu)備液、反應(ying)終體(ti)系(xi)等(deng)(常(chang)溫/冷藏/冷凍/凍融次數限(xian)制(zhi)等(deng)）。
7. 【檢驗方(fang)法】
詳細說明實驗操作的各個步驟，包(bao)括：
（1） 實驗(yan)(yan)條件：實驗(yan)(yan)室分區(qu)、實驗(yan)(yan)環境的溫度、濕(shi)度、空調(diao)氣流方向控制等注意事項。
（2） 試劑配制方(fang)法、注(zhu)意(yi)事項。
（3） 詳(xiang)述核酸(suan)提(ti)(ti)取(qu)的條件、步(bu)驟及注(zhu)意事項。對(dui)照品（質控(kong)品）應參(can)與樣本核酸(suan)的平(ping)行提(ti)(ti)取(qu)，以(yi)對(dui)核酸(suan)提(ti)(ti)取(qu)環節進行合理(li)的質量控(kong)制。
（4） 擴(kuo)增反應前(qian)準備：各(ge)組分加(jia)樣(yang)體積、順序、相關注意事項等。
（5） 逆轉錄過程(cheng)（如涉及）的溫度(du)和時間(jian)設(she)置、PCR各(ge)階(jie)段的溫度(du)、時間(jian)設(she)置、循環數設(she)置及相關注意事項。
（6） 儀器設置：特殊參數，待(dai)測(ce)基因、內標和外(wai)標的熒光通道選(xuan)擇等。
8. 【參考值（參考范圍）】
參(can)考值(zhi)（參(can)考范圍）的(de)(de)描述包括基線(xian)的(de)(de)確定(ding)方法和循(xun)環閾(yu)值(zhi)（Ct值(zhi)）的(de)(de)要(yao)求(qiu)。除Ct值(zhi)要(yao)求(qiu)外，建議結(jie)合是否(fou)出現典型S形曲線(xian)對結(jie)果進行判斷。
9. 【檢(jian)驗結果的解(jie)釋】
結(jie)(jie)合陽性對照、陰(yin)性對照以(yi)及(ji)樣(yang)本管中靶基因和(he)內標的(de)檢(jian)測(ce)結(jie)(jie)果（Ct值），對所(suo)有可能(neng)出(chu)現的(de)結(jie)(jie)果組(zu)合及(ji)相應的(de)解釋進行詳述(shu)(shu)。如存在檢(jian)測(ce)灰區，應對灰區結(jie)(jie)果的(de)處(chu)理(li)方式一(yi)并詳述(shu)(shu)。
10. 【檢(jian)驗方法的局限(xian)性】
（1） 本試(shi)劑盒的檢測結果僅供臨床參考(kao)，對(dui)患者個性化治療的選擇應結合(he)其(qi)癥狀(zhuang)/體征、病史、其(qi)他實驗(yan)室檢查及治療反應等情況綜合(he)考(kao)慮(lv)。
（2） 陰性結果不(bu)能完(wan)全排(pai)除靶基因突變的存在，樣本中腫瘤(liu)細胞過少、過度降解或擴增反應(ying)體系中靶基因濃度低(di)于檢測限亦可造成陰性結果。
（3） 不合理的樣本(ben)采集(ji)、轉運及(ji)處理、以及(ji)不當(dang)的試(shi)驗(yan)(yan)操作和(he)實驗(yan)(yan)環境均有可(ke)能導致假(jia)(jia)陰性(xing)或假(jia)(jia)陽性(xing)結果。
（4） 明確(que)該檢(jian)測僅限于規定的樣本類(lei)型及檢(jian)測系統（包括(kuo)適用機型、核酸提取試劑、檢(jian)測方法等）。
11. 【產品性(xing)能(neng)指標(biao)】
詳(xiang)述以(yi)下性能指(zhi)標：
（1） 對相應(ying)國家參考品(pin)（如(ru)有）檢測的符(fu)合情況。
（2） 最低(di)(di)檢(jian)(jian)測(ce)限（分析靈敏度(du)(du)）：試劑盒能(neng)夠(gou)覆蓋(gai)的(de)(de)(de)所有突(tu)變靶序列的(de)(de)(de)最低(di)(di)檢(jian)(jian)出濃度(du)(du)，重點考慮原(yuan)始模板(ban)中突(tu)變基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)百分率和擴增終體系中核酸濃度(du)(du)兩個因(yin)(yin)素對分析靈敏度(du)(du)的(de)(de)(de)影響。簡單介紹最低(di)(di)檢(jian)(jian)測(ce)限的(de)(de)(de)確定方法以及對最低(di)(di)檢(jian)(jian)測(ce)限驗(yan)證所采用的(de)(de)(de)靶序列的(de)(de)(de)信息。
（3） 企業內部陽(yang)性/陰性參(can)(can)考品(pin)符合(he)率，陽(yang)性/陰性參(can)(can)考品(pin)的組成、來源、濃度梯度設置(zhi)以及評價標(biao)準等信息。
（4） 精密(mi)(mi)度：精密(mi)(mi)度參考品的(de)組成、來源(yuan)、濃(nong)度梯度要求及(ji)評(ping)價(jia)標準。
（5） 分析特異性
①野生(sheng)型驗證：應采用不同(tong)濃(nong)度的野生(sheng)型核(he)酸樣(yang)本進(jin)行(xing)驗證，其(qi)結果應均為陰性。
②試劑盒(he)內交(jiao)叉(cha)反應(ying)：如考核試劑包(bao)括對多個突(tu)變位點(dian)的檢測，則(ze)應(ying)對該試劑盒(he)覆蓋范圍內的所有(you)突(tu)變類型間進行交(jiao)叉(cha)反應(ying)驗證(zheng)。
③序(xu)列(lie)相近或具(ju)有一(yi)定同源性(xing)的其(qi)他較(jiao)常見突變或野生型基因序(xu)列(lie)間的交叉反(fan)應驗證(zheng)。
④潛(qian)在干擾物質(zhi)驗證。
如(ru)果經驗證發(fa)(fa)現某(mou)些序列(lie)與靶序列(lie)的交(jiao)叉(cha)反(fan)應(ying)出(chu)現陽性結(jie)果，則(ze)應(ying)該對存在交(jiao)叉(cha)反(fan)應(ying)的核酸序列(lie)及(ji)濃度進行驗證并在產品說明(ming)書中表明(ming)這種(zhong)假(jia)陽性發(fa)(fa)生(sheng)的可能(neng)，做出(chu)相關的提示。
（6） 對(dui)比(bi)試驗研究(jiu)（如有）：簡要介紹參(can)比(bi)試劑（方(fang)法）的信息、所采(cai)用的統計學(xue)方(fang)法及統計分析結果。
12. 【注意事項】
應至少(shao)包括以(yi)下內容(rong)：
（1） 如該產(chan)品含有人源或動物源性物質，應給出(chu)具有潛(qian)在感染(ran)性的(de)警(jing)告。
（2） 臨(lin)床實驗(yan)室應嚴格按照《醫療機(ji)構臨(lin)床基因擴增管理辦(ban)(ban)法》（衛(wei)辦(ban)(ban)醫政發(fa)〔2010〕194號）等有關分子生物(wu)學實驗(yan)室、臨(lin)床基因擴增實驗(yan)室的管理規范執行。
擬定(ding)產(chan)品(pin)(pin)標準(zhun)應(ying)符合《體(ti)外診斷試劑注冊(ce)管理辦法（試行）》和《體(ti)外診斷試劑注冊(ce)申(shen)報(bao)資(zi)料基(ji)(ji)本要求》的相關規定(ding)。另外，對(dui)于國(guo)產(chan)試劑，應(ying)參考(kao)《中國(guo)生物制品(pin)(pin)規程》（2000年版(ban)），將申(shen)報(bao)產(chan)品(pin)(pin)的主要原材料、生產(chan)工藝及半(ban)成品(pin)(pin)檢定(ding)等內(nei)(nei)容(rong)作為附(fu)(fu)錄(lu)附(fu)(fu)于標準(zhun)正文后，并在(zai)正文的“產(chan)品(pin)(pin)分類”項中引(yin)出該(gai)附(fu)(fu)錄(lu)內(nei)(nei)容(rong)。附(fu)(fu)錄(lu)中應(ying)將待測靶(ba)基(ji)(ji)因的基(ji)(ji)因位點(dian)、引(yin)物/探針設計及來(lai)源(yuan)、參考(kao)品(pin)(pin)設置(zhi)、來(lai)源(yuan)及驗(yan)證(zheng)情況、各種酶的來(lai)源(yuan)、特性及驗(yan)證(zheng)等重點(dian)內(nei)(nei)容(rong)予(yu)以明(ming)確。
腫瘤個體化(hua)用(yong)藥相關基因(yin)突變檢(jian)(jian)測試(shi)劑(ji)的(de)注(zhu)冊檢(jian)(jian)測應(ying)主(zhu)要包括以(yi)下性能指標：物(wu)理性狀、試(shi)劑(ji)盒(he)內陰/陽性對照品（質(zhi)控(kong)品）的(de)Ct值要求（包括內標）、陰/陽性參(can)考(kao)(kao)品符(fu)合(he)(he)率、精密度(du)、最低檢(jian)(jian)測限(xian)（分析靈敏(min)度(du)）等。陽性參(can)考(kao)(kao)品主(zhu)要考(kao)(kao)察對試(shi)劑(ji)盒(he)覆(fu)蓋范圍內不同突變基因(yin)的(de)檢(jian)(jian)測符(fu)合(he)(he)性，陰性參(can)考(kao)(kao)品則(ze)重點對申(shen)報試(shi)劑(ji)的(de)分析特異性進行驗(yan)證。
如果申報試劑已有相(xiang)應的(de)國(guo)家/行業(ye)標(biao)(biao)準發布，則企業(ye)標(biao)(biao)準的(de)要求不得低于國(guo)家/行業(ye)標(biao)(biao)準的(de)要求。
根據《體(ti)外診斷試劑(ji)注冊管理辦法（試行(xing)）》的(de)要求，首(shou)次申請(qing)注冊的(de)第三類產(chan)(chan)(chan)品(pin)應(ying)該在國家(jia)食品(pin)藥品(pin)監(jian)督管理局認可(ke)的(de)、具有相應(ying)承檢(jian)范圍的(de)醫療器械檢(jian)測機構進行(xing)連續3個(ge)生(sheng)產(chan)(chan)(chan)批次樣品(pin)的(de)注冊檢(jian)測。對于已經有國家(jia)標(biao)準品(pin)的(de)檢(jian)測項(xiang)目(mu)，在注冊檢(jian)測時應(ying)采(cai)用(yong)相應(ying)的(de)國家(jia)標(biao)準品(pin)進行(xing),對于目(mu)前尚(shang)無國家(jia)標(biao)準品(pin)的(de)項(xiang)目(mu)，生(sheng)產(chan)(chan)(chan)企業應(ying)建立(li)自己(ji)的(de)參考品(pin)體(ti)系(xi)并提供相應(ying)的(de)內(nei)部參考品(pin)。
應提供主要(yao)原材(cai)料如引(yin)物、探針、企(qi)業參考品的(de)選擇與來源、制備過程、質(zhi)量分析和質(zhi)控標準等相關(guan)研究(jiu)資(zi)料。若主要(yao)原材(cai)料為(wei)企(qi)業自己生產，其(qi)生產工藝必須(xu)相對穩(wen)定，并提交工藝驗(yan)證報(bao)告；如主要(yao)原材(cai)料購自其(qi)他供貨商(shang)，應提供的(de)資(zi)料包括：對物料供應商(shang)審(shen)核的(de)相關(guan)資(zi)料、供貨方提供的(de)質(zhi)量標準、出廠檢定報(bao)告，以及該原材(cai)料到貨后的(de)質(zhi)量檢驗(yan)資(zi)料。
1. 核(he)酸分離(li)/純化組(zu)分（如有）的(de)主要組(zu)成、原理介紹及相(xiang)關的(de)驗(yan)證資料。
2. PCR和/或RT-PCR組(zu)分的主要(yao)原料(liao)(liao)（包括引物、探針、各種酶及(ji)(ji)其他主要(yao)原料(liao)(liao)）的選擇、制備、質(zhi)量標準及(ji)(ji)實驗(yan)研究(jiu)資料(liao)(liao)，主要(yao)包括以下內容：
（1） 脫(tuo)氧三(san)磷酸核苷（dNTP）
核酸(suan)的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和(he)dTTP，對(dui)純度(du)、濃度(du)、保存穩定性等(deng)的驗(yan)證資料。
（2） 引物
由一(yi)定(ding)(ding)數量(liang)的(de)(de)dNTP構成(cheng)(cheng)的(de)(de)特定(ding)(ding)序列(lie)，通(tong)常采用(yong)DNA合(he)(he)成(cheng)(cheng)儀人工合(he)(he)成(cheng)(cheng)，合(he)(he)成(cheng)(cheng)后經(jing)聚(ju)丙烯酰胺凝膠電(dian)泳（PAGE）或其他適宜方(fang)法純化。需提(ti)供(gong)對(dui)分子(zi)量(liang)、純度、穩定(ding)(ding)性、功能性實(shi)驗等(deng)的(de)(de)驗證資料。如為外購，應提(ti)供(gong)合(he)(he)成(cheng)(cheng)機構出具的(de)(de)合(he)(he)成(cheng)(cheng)產物的(de)(de)質檢(jian)證明，如PAGE電(dian)泳結果或高效(xiao)液(ye)相色譜(pu)法（HPLC）分析圖譜(pu)。
（3） 探針
特定(ding)的(de)(de)帶有示(shi)蹤(zong)物(wu)（標記物(wu)）的(de)(de)已知(zhi)核(he)酸片(pian)段(duan)（寡聚核(he)苷酸片(pian)段(duan)），能與互補核(he)酸序列(lie)(lie)退火雜交，用(yong)于特定(ding)核(he)酸序列(lie)(lie)的(de)(de)探(tan)測。合(he)成(cheng)后經聚丙(bing)烯酰胺凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳（PAGE）或其(qi)他適宜方(fang)法純化，在5-端(和/或3-端)進行(xing)標記，并(bing)經HPLC或其(qi)他適宜方(fang)法純化，純度應達到HPLC純。應提供合(he)成(cheng)機構出具的(de)(de)合(he)成(cheng)產物(wu)的(de)(de)質檢(jian)證明，如HPLC分析圖譜，應對探(tan)針的(de)(de)分子量及(ji)標記的(de)(de)熒光素進行(xing)核(he)實，并(bing)進行(xing)功能性試驗(yan)驗(yan)證。
（4） 酶(mei)
DNA聚合(he)酶(mei)(mei)，應(ying)具有(you)DNA聚合(he)酶(mei)(mei)活(huo)性(xing)(xing)(xing)，無(wu)(wu)核(he)酸內切(qie)酶(mei)(mei)活(huo)性(xing)(xing)(xing)，具熱穩定性(xing)(xing)(xing)，如：94℃保(bao)溫1小時(shi)后仍(reng)保(bao)持50%活(huo)性(xing)(xing)(xing)；尿嘧啶糖基(ji)化酶(mei)(mei)（UNG），具有(you)尿嘧啶糖基(ji)化活(huo)性(xing)(xing)(xing)，無(wu)(wu)核(he)酸外切(qie)酶(mei)(mei)及(ji)核(he)酸內切(qie)酶(mei)(mei)活(huo)性(xing)(xing)(xing)，應(ying)對酶(mei)(mei)活(huo)性(xing)(xing)(xing)有(you)合(he)理驗證；逆(ni)轉(zhuan)錄酶(mei)(mei)，具逆(ni)轉(zhuan)錄酶(mei)(mei)活(huo)性(xing)(xing)(xing)，無(wu)(wu)核(he)酸內切(qie)酶(mei)(mei)活(huo)性(xing)(xing)(xing)。
3. 核酸(suan)類(lei)檢測(ce)試劑的包裝材料和(he)耗(hao)材應無DNase和(he)RNase污染。
4. 企業內部參考(kao)(kao)品(pin)：應詳細說(shuo)明有關企業內部參考(kao)(kao)品(pin)的原料(liao)選擇、制(zhi)備、定值(zhi)過(guo)程等試(shi)驗資料(liao)。具體要求如下：
（1） 陽性參考品(pin)
試劑(ji)盒(he)（分型(xing)或不分型(xing)）所能覆蓋的(de)所有突(tu)變位點(dian)均應設(she)(she)置(zhi)相(xiang)應的(de)陽性參考品(pin)，每(mei)個突(tu)變位點(dian)設(she)(she)置(zhi)至少三個突(tu)變百分率梯度(du)，其(qi)中需包括至少一份弱陽性參考品(pin)。陽性參考品(pin)的(de)突(tu)變形(xing)式及濃度(du)需經過(guo)金標準方法或已(yi)上市同類(lei)分型(xing)試劑(ji)的(de)確(que)認。
如(ru)(ru)申報試劑用(yong)(yong)(yong)于DNA樣(yang)(yang)本(ben)的(de)檢(jian)測，則陽(yang)性參考(kao)品(pin)(pin)可(ke)以采(cai)用(yong)(yong)(yong)臨床樣(yang)(yang)本(ben)提取的(de)DNA儲備液或相(xiang)應(ying)質粒(li)作為原料。如(ru)(ru)申報試劑用(yong)(yong)(yong)于RNA樣(yang)(yang)本(ben)的(de)檢(jian)測，陽(yang)性參考(kao)品(pin)(pin)可(ke)以采(cai)用(yong)(yong)(yong)臨床樣(yang)(yang)本(ben)提取的(de)RNA儲備液、相(xiang)應(ying)RNA凍干粉或假病毒的(de)形(xing)式(shi)；如(ru)(ru)覆蓋突(tu)變(bian)位(wei)(wei)點過(guo)多(duo)，可(ke)以對(dui)其(qi)中部分突(tu)變(bian)位(wei)(wei)點采(cai)用(yong)(yong)(yong)質粒(li)的(de)形(xing)式(shi)，但(dan)不(bu)能全(quan)部采(cai)用(yong)(yong)(yong)質粒(li)，需包括部分突(tu)變(bian)類型(xing)（申請(qing)人自行確定其(qi)代(dai)表(biao)性）RNA為模(mo)板(ban)的(de)陽(yang)性參考(kao)品(pin)(pin)以對(dui)逆轉錄(lu)（RT）過(guo)程進(jin)行監控(kong)。
（2） 陰性參考品
可采用源于健康人、經確認無相應靶突(tu)變序列(lie)的野生型DNA儲(chu)存液。
（3） 靈敏度參考品（檢(jian)測限參考品）
靈敏度(du)參考(kao)(kao)品的(de)原料要求參考(kao)(kao)陽性參考(kao)(kao)品，需包括所(suo)有的(de)突變類型，可以僅(jin)設置分(fen)析靈敏度(du)水平的(de)一個濃度(du)即(ji)可。
（4） 精(jing)密度參考品(pin)
精(jing)密度(du)(du)參(can)(can)(can)考品(pin)原料(liao)要求參(can)(can)(can)考陽(yang)性(xing)參(can)(can)(can)考品(pin)，需包(bao)(bao)括(kuo)陰性(xing)、弱陽(yang)性(xing)、中或強陽(yang)性(xing)三個濃度(du)(du)水平(ping)的精(jing)密度(du)(du)驗證，陰性(xing)和中/強陽(yang)性(xing)精(jing)密度(du)(du)參(can)(can)(can)考品(pin)可(ke)不必包(bao)(bao)括(kuo)所有(you)突變類(lei)型，以(yi)常見突變類(lei)型（申(shen)請人(ren)自行(xing)確定其代表性(xing)）為主，但弱陽(yang)性(xing)參(can)(can)(can)考品(pin)需包(bao)(bao)括(kuo)所有(you)突變位點。
5. 試劑(ji)盒內對照品（質控品）
試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)的(de)(de)質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)體(ti)系(xi)通過設置(zhi)各種試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)對(dui)(dui)照品(pin)來實現，質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)體(ti)系(xi)需考慮(lv)對(dui)(dui)樣(yang)(yang)本核酸(suan)提取、配液及加樣(yang)(yang)、試(shi)(shi)(shi)劑(ji)及儀(yi)器性(xing)(xing)(xing)能(neng)、擴(kuo)增反應(ying)抑(yi)制物（管內抑(yi)制）、交叉污染、靶核酸(suan)降解等(deng)因素可(ke)能(neng)造成的(de)(de)假(jia)陰性(xing)(xing)(xing)或假(jia)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)結果進行合理(li)的(de)(de)質(zhi)(zhi)(zhi)量控(kong)(kong)制。所(suo)有陽(yang)性(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)照品(pin)的(de)(de)核酸(suan)性(xing)(xing)(xing)質(zhi)(zhi)(zhi)應(ying)與待測樣(yang)(yang)本的(de)(de)靶核酸(suan)性(xing)(xing)(xing)質(zhi)(zhi)(zhi)一致，如同為DNA或RNA。申報(bao)(bao)資(zi)(zi)料(liao)應(ying)對(dui)(dui)試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)對(dui)(dui)照品(pin)有關(guan)原料(liao)選(xuan)擇、制備(bei)、定值過程(cheng)等(deng)試(shi)(shi)(shi)驗(yan)資(zi)(zi)料(liao)詳細(xi)說(shuo)明。申請人應(ying)視申報(bao)(bao)產品(pin)具體(ti)情況設置(zhi)合理(li)的(de)(de)試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)對(dui)(dui)照品(pin)（質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)品(pin)），試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)質(zhi)(zhi)(zhi)控(kong)(kong)體(ti)系(xi)主要(yao)(yao)考慮(lv)以下(xia)幾(ji)方面要(yao)(yao)求。
（1） 陽(yang)性對(dui)照品(pin)（質控品(pin)）
建議對(dui)(dui)每個樣(yang)品(pin)反(fan)應(ying)(ying)(ying)管設置至少一(yi)份陽(yang)性(xing)對(dui)(dui)照(zhao)(zhao)品(pin)（質控品(pin)），陽(yang)性(xing)對(dui)(dui)照(zhao)(zhao)品(pin)應(ying)(ying)(ying)參與樣(yang)本核酸的(de)平行提取(qu)(qu)，以(yi)對(dui)(dui)樣(yang)本提取(qu)(qu)、試劑及儀器性(xing)能、擴(kuo)增反(fan)應(ying)(ying)(ying)過程等環節進(jin)行質量控制(zhi)，企業應(ying)(ying)(ying)對(dui)(dui)各種陽(yang)性(xing)對(dui)(dui)照(zhao)(zhao)（質控）品(pin)的(de)Ct值做(zuo)出明(ming)確(que)的(de)范圍要求。如樣(yang)本反(fan)應(ying)(ying)(ying)管內可(ke)以(yi)覆(fu)蓋多(duo)種突(tu)變(bian)序列的(de)檢測（分(fen)型或不(bu)分(fen)型），相應(ying)(ying)(ying)的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)(dui)照(zhao)(zhao)管可(ke)以(yi)不(bu)必涉及所有突(tu)變(bian)類型，但應(ying)(ying)(ying)選擇(ze)較(jiao)常見突(tu)變(bian)序列或理論(lun)上較(jiao)難測得(de)的(de)突(tu)變(bian)序列作為(wei)陽(yang)性(xing)對(dui)(dui)照(zhao)(zhao)。
（2） 內(nei)對照（內(nei)標）
內(nei)對(dui)照(zhao)(zhao)（內(nei)標）可以對(dui)管(guan)內(nei)抑制導致(zhi)的假陰(yin)性結果(guo)進行質(zhi)量控制，尤(you)其是靶核(he)酸為RNA、用(yong)于基因(yin)重排或(huo)(huo)基因(yin)表(biao)達異常等檢(jian)測目的時(shi)，可以采用(yong)管(guan)家基因(yin)或(huo)(huo)與(yu)靶基因(yin)濃度(du)水平相當(dang)的其他基因(yin)序(xu)列作為相應(ying)的內(nei)對(dui)照(zhao)(zhao)（內(nei)標）。申請人應(ying)對(dui)內(nei)對(dui)照(zhao)(zhao)（內(nei)標）的引物、探針和模板濃度(du)做(zuo)精確驗證(zheng)，既要保證(zheng)內(nei)標熒光(guang)通道呈明顯的陽性曲線又要盡(jin)量降低(di)對(dui)靶基因(yin)檢(jian)測造成的抑制而(er)導致(zhi)假陰(yin)性。
（3） 陰性對照
陰性對照對可能存(cun)在的交叉污染進行假陽性結(jie)果的質控。
生產工(gong)藝(yi)及(ji)反應(ying)體系(xi)的研究資料(liao)應(ying)能對(dui)反應(ying)體系(xi)涉及(ji)到的基本內(nei)容，如臨(lin)床樣本用(yong)量、試劑用(yong)量、反應(ying)條件、質控體系(xi)設置、Ct（臨(lin)界）值確(que)定等，提供確(que)切的依據，配制(zhi)(zhi)工(gong)作液的各(ge)種原材(cai)料(liao)及(ji)其配比(bi)應(ying)符合(he)要求，原材(cai)料(liao)應(ying)混合(he)均勻(yun)，配制(zhi)(zhi)過(guo)程應(ying)對(dui)pH、電導率等關(guan)鍵參數進行有效控制(zhi)(zhi)。主要包(bao)括以下內(nei)容：
1. 主要生(sheng)產工藝介紹，可以圖表(biao)方(fang)式表(biao)示(shi)。
2. 反應原理介紹。
3. 基因位點(dian)選擇、(RT)-PCR方法學特性(xing)介紹。
4. 確定(ding)最佳(RT)-PCR反應(ying)體系的研究(jiu)資料，包括酶濃(nong)度(du)、引(yin)物(wu)/探針(zhen)濃(nong)度(du)、dNTP濃(nong)度(du)、陽離子濃(nong)度(du)等。
5. 確定逆轉錄過程（如涉及）的溫度和時間(jian)的研究(jiu)資(zi)料(liao)，PCR反應(ying)各階段溫度、時間(jian)及循環數的研究(jiu)資(zi)料(liao)。
6. 對于基線閾值(zhi)（threshold）和(he)閾值(zhi)循環數（Ct）確定(ding)的研(yan)究(jiu)資(zi)料。
7. 不同(tong)適(shi)用機型的反應(ying)條件如果有差異應(ying)分(fen)別詳(xiang)述。
8. 如(ru)申報產品(pin)包含核酸提取試劑，應(ying)提交對核酸提取過程進行工藝(yi)優化的研究資(zi)料(liao)。
企(qi)業(ye)應提交在(zai)產(chan)品研(yan)制(zhi)階段對試劑(ji)盒進行的所有性(xing)(xing)(xing)能驗(yan)證(zheng)的研(yan)究資料(liao)，包括具體(ti)研(yan)究方(fang)法、內控標(biao)準(zhun)、實驗(yan)數(shu)據、統計分(fen)析(xi)等詳細資料(liao)。建議著重(zhong)對以下分(fen)析(xi)性(xing)(xing)(xing)能進行研(yan)究。如有相應的國(guo)家參考(kao)品，應在(zai)分(fen)析(xi)性(xing)(xing)(xing)能評估階段采用國(guo)家參考(kao)品對產(chan)品性(xing)(xing)(xing)能進行驗(yan)證(zheng)。
1. 樣本(ben)核酸提取
樣(yang)本(ben)核(he)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)提(ti)(ti)取主要(yao)有以下(xia)目的(de)(de)(de)(de)(de)：富集(ji)靶核(he)酸(suan)(suan)濃(nong)度(du)、保(bao)(bao)證靶核(he)酸(suan)(suan)序(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)完(wan)整(zheng)性(xing)、增(zeng)加(jia)PCR模板溶液均(jun)一性(xing)、去(qu)除PCR抑制物(wu)，樣(yang)本(ben)核(he)酸(suan)(suan)提(ti)(ti)取是決定后(hou)續核(he)酸(suan)(suan)擴增(zeng)過(guo)程成敗的(de)(de)(de)(de)(de)要(yao)素(su)之(zhi)一。尤其(qi)(qi)是石蠟包埋(mai)組織樣(yang)本(ben)在福爾馬林固定過(guo)程中(zhong)，會使樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)酸(suan)(suan)與核(he)酸(suan)(suan)之(zhi)間，核(he)酸(suan)(suan)與蛋白之(zhi)間發生(sheng)交聯(lian)，并(bing)且樣(yang)本(ben)在不(bu)當的(de)(de)(de)(de)(de)保(bao)(bao)存條件下(xia)容易造(zao)成核(he)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)片段化(hua)或(huo)降解，增(zeng)加(jia)了核(he)酸(suan)(suan)提(ti)(ti)取的(de)(de)(de)(de)(de)難度(du)。因(yin)此，無論申(shen)報產(chan)品(pin)是否含(han)有核(he)酸(suan)(suan)分(fen)離(li)/純(chun)(chun)化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)組分(fen)，企業(ye)都應(ying)對核(he)酸(suan)(suan)提(ti)(ti)取的(de)(de)(de)(de)(de)環節做充分(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)驗證。除最(zui)大量分(fen)離(li)出(chu)目的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)酸(suan)(suan)外(wai)，還應(ying)有相應(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)純(chun)(chun)化(hua)步(bu)驟，盡(jin)可(ke)能去(qu)除PCR抑制物(wu)。常見(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)酸(suan)(suan)分(fen)離(li)純(chun)(chun)化(hua)均(jun)有其(qi)(qi)優勢和不(bu)足，申(shen)請人應(ying)結合申(shen)報產(chan)品(pin)的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)性(xing)，合理選擇核(he)酸(suan)(suan)分(fen)離(li)/純(chun)(chun)化(hua)試劑，并(bing)提(ti)(ti)供詳細的(de)(de)(de)(de)(de)驗證資(zi)料。
2. 陽性/陰性參考(kao)品符合(he)率(lv)
各(ge)水(shui)平、各(ge)突變位點的陽性(xing)(xing)參(can)考(kao)品均應(ying)(ying)按要(yao)求檢(jian)出陽性(xing)(xing)，考(kao)慮到(dao)濃度梯度的不同，應(ying)(ying)對各(ge)水(shui)平陽性(xing)(xing)參(can)考(kao)品設(she)置(zhi)相應(ying)(ying)Ct值(zhi)的限制；陰性(xing)(xing)參(can)考(kao)品在(zai)各(ge)個(ge)引物(wu)探針(zhen)組合(he)的檢(jian)測條(tiao)件下均應(ying)(ying)檢(jian)出為(wei)陰性(xing)(xing)；如有野生(sheng)型參(can)考(kao)品的設(she)置(zhi)，在(zai)其相應(ying)(ying)的引物(wu)探針(zhen)組合(he)下檢(jian)測應(ying)(ying)為(wei)陽性(xing)(xing)。
3. 最低(di)檢測限（分(fen)析(xi)靈敏度）
建議采用95%（n≥20）的(de)(de)(de)陽性檢出(chu)率(lv)作為最低檢測限(xian)確定的(de)(de)(de)標準，擴增反應終(zhong)體系(xi)中的(de)(de)(de)突變序列百分率(lv)和總核酸濃度(du)兩個因素(su)對分析靈敏度(du)的(de)(de)(de)影響(xiang)較大(da)，終(zhong)體系(xi)中突變序列的(de)(de)(de)百分率(lv)越高、所含的(de)(de)(de)DNA（RNA）量(liang)越多(duo)，則(ze)越容易檢出(chu)。因此，試劑盒(he)最低檢測限(xian)主要(yao)考(kao)慮(lv)以下兩種情形。
（1） 在擴增(zeng)反(fan)應終體系特定核酸濃度下，突(tu)變序列所占(zhan)百分率的(de)最低檢測限。
采用野生型臨(lin)床(chuang)樣本(ben)(ben)和較(jiao)高突(tu)變百分(fen)率的(de)(de)臨(lin)床(chuang)樣本(ben)(ben)提取的(de)(de)核酸儲(chu)備液進(jin)行(xing)混(hun)(hun)合(he)，確(que)定擴(kuo)增反應終(zhong)體(ti)系中的(de)(de)核酸濃(nong)度，采用合(he)理的(de)(de)試驗方法（如深測序(xu)）對混(hun)(hun)合(he)后(hou)樣本(ben)(ben)中突(tu)變序(xu)列所占百分(fen)率進(jin)行(xing)確(que)認，并逐漸調整野生型和突(tu)變型核酸儲(chu)備液的(de)(de)比(bi)例以(yi)得(de)到(dao)(dao)含不同突(tu)變序(xu)列百分(fen)率的(de)(de)混(hun)(hun)合(he)液，對各份(fen)混(hun)(hun)合(he)液進(jin)行(xing)不少于20次(ci)的(de)(de)重復檢(jian)測，確(que)定95%陽(yang)性檢(jian)出率水平，作為在固定的(de)(de)核酸濃(nong)度條(tiao)件(jian)下(xia)，可以(yi)檢(jian)測到(dao)(dao)的(de)(de)最低的(de)(de)突(tu)變序(xu)列百分(fen)率。
舉(ju)例：在50ng/40ul水平，可以達到95%陽(yang)性檢出率的最低(di)突變序列百(bai)分率為10%。
（2） 在特定突變(bian)序列百分率下，反應終體(ti)系(xi)中核酸濃度的最低(di)檢測(ce)限。
采(cai)用合(he)理的(de)(de)實驗方法確定(ding)待測樣(yang)本中(zhong)的(de)(de)突變序(xu)列所占的(de)(de)百分率（如固定(ding)在10%的(de)(de)水(shui)平(ping)），再逐級稀釋成不同核酸濃(nong)度(du)(du)樣(yang)本，分別對各梯度(du)(du)濃(nong)度(du)(du)樣(yang)本進行不少于20次(ci)的(de)(de)重復檢測，確定(ding)95%陽性檢出(chu)率的(de)(de)最低(di)DNA（RNA）濃(nong)度(du)(du)。
舉例(li)：在(zai)10%的突變序列百分率水(shui)平(ping)，40ul擴增反應(ying)終體系中，DNA濃度的最低檢測(ce)限(xian)為50ng/40ul。
（3） 評價腫瘤組織含量(liang)、DNA（RNA）降解等因素對分析(xi)靈(ling)敏(min)度可能造(zao)成(cheng)的影(ying)響。
4. 分析(xi)特異性
（1） 野(ye)生(sheng)型驗(yan)證(zheng)：采用(yong)不同(tong)濃度的(de)野(ye)生(sheng)型核(he)酸樣本進行驗(yan)證(zheng)，結果應為陰(yin)性。
（2） 交(jiao)叉反應，對于此類產品的(de)交(jiao)叉反應驗證主要考慮以下幾方面情形：
①申報試劑所覆蓋的全部突(tu)變類型間的交(jiao)叉(cha)反(fan)應；
②核酸序(xu)列具有同(tong)源性、易引起交(jiao)叉反(fan)應的野(ye)生(sheng)型或其(qi)它突變類型間的交(jiao)叉反(fan)應。
申請(qing)人(ren)應(ying)(ying)提供所有用于交(jiao)叉反應(ying)(ying)驗(yan)證的突變或野(ye)生型(xing)序列(lie)(lie)、序列(lie)(lie)確認和濃度選擇等試驗(yan)資(zi)料(liao)。有關交(jiao)叉反應(ying)(ying)驗(yan)證的信息應(ying)(ying)以列(lie)(lie)表的方式在產(chan)品說明書(shu)的【產(chan)品性能(neng)指標】項(xiang)中有所體現。
（3） 干擾物(wu)質(zhi)
①申請人(ren)應根(gen)據試劑(ji)盒所采用的樣本類型(xing)，確定潛在的干擾物(wu)質(zhi)。
②用(yong)于干擾(rao)試驗(yan)的樣(yang)本，靶(ba)基因濃度(du)(du)應(ying)至少包(bao)含弱陽性，而不應(ying)僅選擇強陽性樣(yang)本，使用(yong)醫學相關水平的干擾(rao)物質進行(xing)驗(yan)證(zheng)。此外，建(jian)議申請人同時(shi)在(zai)每(mei)種(zhong)干擾(rao)物質的潛在(zai)最(zui)大濃度(du)(du)(“最(zui)差(cha)條件”)條件下同樣(yang)進行(xing)評價。
有關干擾物質的研究結果亦(yi)應總(zong)結于(yu)產(chan)品說(shuo)明書的【產(chan)品性能(neng)指標】項下。
5. 精密度(du)
測量精(jing)密(mi)(mi)度的(de)(de)評(ping)(ping)價方法并(bing)無(wu)統一的(de)(de)標(biao)(biao)(biao)準可(ke)(ke)依，可(ke)(ke)根據不同產(chan)品(pin)特征(zheng)或(huo)企業(ye)的(de)(de)研究習(xi)慣進行，前提是(shi)必(bi)須保證研究的(de)(de)科(ke)學合(he)理性(xing)。具體實驗方法可(ke)(ke)以參(can)考國際或(huo)國內有關體外診斷產(chan)品(pin)性(xing)能評(ping)(ping)估的(de)(de)文件(jian)進行。企業(ye)應(ying)對(dui)每項(xiang)精(jing)密(mi)(mi)度指標(biao)(biao)(biao)的(de)(de)評(ping)(ping)價標(biao)(biao)(biao)準做出合(he)理要求(qiu)，如標(biao)(biao)(biao)準差(cha)或(huo)變異系數的(de)(de)范(fan)圍(wei)等(deng)。針對(dui)本類產(chan)品(pin)的(de)(de)精(jing)密(mi)(mi)度評(ping)(ping)價主要包括以下(xia)要求(qiu)。
（1） 對可能(neng)影響(xiang)檢測精密(mi)度的(de)主要變量進行(xing)驗(yan)(yan)證(zheng)，除申(shen)報試劑（包括(kuo)提取(qu)組分）本身的(de)影響(xiang)外，還(huan)應對PCR分析(xi)儀、操作(zuo)者、地(di)點等要素進行(xing)相關的(de)驗(yan)(yan)證(zheng)。
（2） 合(he)理的精密度(du)評價(jia)周期，例如(ru)：為期至少20天的連續檢測，每天至少由2人完(wan)(wan)成不(bu)少于2次的完(wan)(wan)整檢測，從而(er)對批內/批間、日(ri)內/日(ri)間以及(ji)不(bu)同操作者之間的精密度(du)進(jin)行(xing)綜合(he)評價(jia)。如(ru)有(you)條件，申請(qing)人應(ying)選(xuan)擇不(bu)同的實驗(yan)室進(jin)行(xing)重(zhong)復(fu)實驗(yan)以對室間精密度(du)進(jin)行(xing)評價(jia)。
（3） 用于精密(mi)度(du)評(ping)價的質控品(pin)應至少包括3個水平:
①陰性參考品：待測靶核酸濃度低于最低檢測限或為零濃度，建議選用背景(jing)值較高(gao)的陰性樣(yang)本，陰性符合率應為100%（n≥20）。
②弱陽(yang)性(xing)參(can)(can)考品：待測靶核(he)(he)酸濃度略(lve)高于試劑盒的(de)最低檢測限，陽(yang)性(xing)檢出率應達(da)到100%（n≥20）。注：弱陽(yang)性(xing)參(can)(can)考品需包(bao)括所(suo)有(you)的(de)突變(bian)位點(dian)，如(ru)果待測物(wu)靶核(he)(he)酸為(wei)(wei)RNA，則弱陽(yang)性(xing)精(jing)密(mi)度參(can)(can)考品中(zhong)應至(zhi)少部(bu)分(fen)典型突變(bian)位點(dian)的(de)原料(liao)為(wei)(wei)RNA，如(ru)RNA干粉或相應的(de)假病(bing)毒。
③高濃(nong)度(du)參考(kao)品(pin)：待測(ce)靶核酸呈中(zhong)(zhong)到強陽性(xing)的濃(nong)度(du)，陽性(xing)檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。注：如(ru)果試劑(ji)盒可(ke)(ke)以(yi)覆蓋多個突(tu)變(bian)位(wei)點(dian)的檢測(ce)，該參考(kao)品(pin)可(ke)(ke)以(yi)設置為對全部突(tu)變(bian)位(wei)點(dian)進行精密度(du)驗(yan)證，也可(ke)(ke)以(yi)選擇其中(zhong)(zhong)部分突(tu)變(bian)位(wei)點(dian)進行驗(yan)證，但應至少包(bao)含常(chang)見突(tu)變(bian)序(xu)列(lie)或理論上(shang)較(jiao)難測(ce)得的突(tu)變(bian)序(xu)列(lie)。
6. 其他需注(zhu)意問題
對于(yu)適(shi)用(yong)多(duo)個機型(xing)的(de)產(chan)品，應提供如產(chan)品說明(ming)書【適(shi)用(yong)機型(xing)】項中所(suo)列的(de)所(suo)有型(xing)號儀器(qi)的(de)性(xing)能評(ping)估(gu)資料(liao)。若(ruo)試劑(ji)盒(he)適(shi)用(yong)的(de)樣本(ben)類(lei)型(xing)不止一種，如既(ji)包(bao)含石(shi)蠟包(bao)埋組織切片(pian)亦(yi)包(bao)含冷凍(dong)組織切片(pian)或(huo)血液樣本(ben)等，則(ze)需對所(suo)有樣本(ben)類(lei)型(xing)的(de)適(shi)用(yong)性(xing)進行評(ping)估(gu)，并提交評(ping)估(gu)資料(liao)。
對于此類試(shi)劑，參考值(zhi)(zhi)確定資料主要是指Ct值(zhi)(zhi)的確認資料，建(jian)議申請人采用受(shou)試(shi)者工(gong)作特征(zheng)（ROC）曲線的方式(shi)對申報產(chan)品用于結果判(pan)斷的臨界值(zhi)(zhi)予(yu)以確認。
穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)研(yan)究(jiu)(jiu)資料(liao)主(zhu)要(yao)涉(she)及(ji)兩部分內容(rong)，申報試劑(ji)的(de)穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)和適用樣(yang)本的(de)穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)研(yan)究(jiu)(jiu)。前(qian)者主(zhu)要(yao)包括實(shi)時穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)（有效(xiao)期）、開瓶(ping)穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)、復溶穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)、運(yun)輸穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)及(ji)凍融次數(shu)限制等研(yan)究(jiu)(jiu)，申請人(ren)可根據實(shi)際(ji)需要(yao)選擇合理的(de)穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)研(yan)究(jiu)(jiu)方(fang)(fang)案。穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)研(yan)究(jiu)(jiu)資料(liao)應(ying)包括研(yan)究(jiu)(jiu)方(fang)(fang)法的(de)確定(ding)(ding)(ding)依據、具體(ti)的(de)實(shi)施方(fang)(fang)案、詳細(xi)的(de)研(yan)究(jiu)(jiu)數(shu)據以(yi)及(ji)結論。對于實(shi)時穩定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)研(yan)究(jiu)(jiu)，應(ying)提供至(zhi)少三(san)批(pi)樣(yang)品(pin)(pin)在實(shi)際(ji)儲存(cun)條件下保存(cun)至(zhi)成品(pin)(pin)有效(xiao)期后(hou)的(de)研(yan)究(jiu)(jiu)資料(liao)。
另外，樣(yang)本(ben)(ben)(ben)穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)的(de)(de)研(yan)究對(dui)(dui)于實驗的(de)(de)成敗也至關重(zhong)要(yao)。特別是當使(shi)用標本(ben)(ben)(ben)類(lei)型包(bao)括組織標本(ben)(ben)(ben)時，腫(zhong)瘤(liu)組織標本(ben)(ben)(ben)經過特殊處理后其核(he)酸序列的(de)(de)完整性(xing)容易(yi)遭到破(po)壞(huai)，因此應提(ti)供對(dui)(dui)樣(yang)本(ben)(ben)(ben)保(bao)存(cun)條(tiao)件、保(bao)存(cun)時間(jian)等方(fang)面的(de)(de)詳(xiang)細(xi)研(yan)究資料(liao)。樣(yang)本(ben)(ben)(ben)穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)研(yan)究主要(yao)包(bao)括核(he)酸提(ti)取前樣(yang)本(ben)(ben)(ben)穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)和(he)提(ti)取后核(he)酸在儲備液中(zhong)的(de)(de)穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)兩方(fang)面。在合理的(de)(de)溫(wen)度范圍內選(xuan)擇多個溫(wen)度點（應至少包(bao)括范圍的(de)(de)上限和(he)下限溫(wen)度），每間(jian)隔一定(ding)(ding)的(de)(de)時間(jian)段即對(dui)(dui)儲存(cun)樣(yang)本(ben)(ben)(ben)進(jin)行全性(xing)能(neng)的(de)(de)分析驗證(zheng)，從而(er)確(que)認不(bu)同類(lei)型樣(yang)本(ben)(ben)(ben)的(de)(de)穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)。適(shi)于冷(leng)凍(dong)(dong)保(bao)存(cun)的(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)(ben)還應對(dui)(dui)凍(dong)(dong)融(rong)次數(shu)進(jin)行評價。
試劑(ji)穩定性(xing)和樣(yang)本穩定性(xing)兩(liang)(liang)部分內容的研究(jiu)結(jie)果均應在(zai)說(shuo)(shuo)明書(shu)【儲存條(tiao)件(jian)及有(you)效(xiao)期】和【樣(yang)本要求(qiu)】兩(liang)(liang)項(xiang)中進(jin)行(xing)詳細(xi)說(shuo)(shuo)明。
對于國內外尚無同類(lei)產品被批(pi)準上市的(de)(de)新的(de)(de)腫瘤相(xiang)關(guan)基因突變，相(xiang)關(guan)檢(jian)測試(shi)劑進(jin)行臨床研(yan)究(jiu)時，申請(qing)人應(ying)將試(shi)劑盒臨床研(yan)究(jiu)納入(ru)相(xiang)關(guan)藥(yao)物(wu)的(de)(de)臨床研(yan)究(jiu)或(huo)臨床應(ying)用中(zhong)，通過(guo)對特(te)定的(de)(de)腫瘤病人進(jin)行治(zhi)療前后的(de)(de)跟蹤隨訪，以臨床對于患者(zhe)個體化治(zhi)療方案及有(you)效(xiao)性的(de)(de)綜(zong)合判(pan)斷為金標準，評價此類(lei)試(shi)劑用于指(zhi)導腫瘤個體化用藥(yao)的(de)(de)臨床性能。研(yan)究(jiu)者(zhe)應(ying)明確(que)研(yan)究(jiu)對象的(de)(de)入(ru)選(xuan)標準、隨訪標準和隨訪時間。有(you)關(guan)此類(lei)臨床研(yan)究(jiu)的(de)(de)方案設計和評價標準等(deng)應(ying)符(fu)合體外診(zhen)斷試(shi)劑及藥(yao)物(wu)臨床研(yan)究(jiu)相(xiang)關(guan)法(fa)規要求。
對(dui)于已有(you)(you)同類(lei)產品上市的、基因突變與腫瘤個體化(hua)用藥(yao)方(fang)案的相關性已經得(de)到確認(ren)的產品，則申請人(ren)既(ji)可(ke)采用試劑盒(he)檢(jian)測與相關藥(yao)物治(zhi)療(liao)相結(jie)合對(dui)特(te)定的腫瘤病人(ren)進行治(zhi)療(liao)前后的跟蹤臨床(chuang)研究(jiu)的方(fang)法，亦可(ke)在充分結(jie)合相關的病例信息的情(qing)況下，采用考核試劑與參比(bi)(bi)方(fang)法進行對(dui)比(bi)(bi)試驗的研究(jiu)方(fang)法，對(dui)考核試劑的臨床(chuang)應用有(you)(you)效性進行評價(jia)。以下要求(qiu)均針對(dui)采用對(dui)比(bi)(bi)試驗方(fang)法的臨床(chuang)研究(jiu)提出(chu)。
1. 參比方(fang)法的(de)選擇可以考慮以下幾方(fang)面：
（1） 如已(yi)(yi)(yi)有同(tong)類(lei)產(chan)品(pin)上(shang)市(shi)，其臨床研(yan)究(jiu)可(ke)以選擇(ze)(ze)境內(nei)已(yi)(yi)(yi)批準上(shang)市(shi)、臨床普遍認為質量較好的同(tong)類(lei)產(chan)品(pin)作為參(can)比(bi)(bi)試(shi)劑，采用擬(ni)申(shen)(shen)報(bao)產(chan)品(pin)（以下稱考(kao)核試(shi)劑）與之進行對比(bi)(bi)試(shi)驗研(yan)究(jiu)，證明本品(pin)與已(yi)(yi)(yi)上(shang)市(shi)產(chan)品(pin)等(deng)效或優于(yu)已(yi)(yi)(yi)上(shang)市(shi)產(chan)品(pin)。但應充分考(kao)慮已(yi)(yi)(yi)上(shang)市(shi)同(tong)類(lei)試(shi)劑的突變位點(dian)選擇(ze)(ze)、靶(ba)序(xu)列選擇(ze)(ze)、分析靈(ling)敏度等(deng)特性，確保考(kao)核試(shi)劑與申(shen)(shen)報(bao)試(shi)劑具有明確可(ke)比(bi)(bi)性。
（2） 申請人亦可采用核(he)酸序列(lie)測定(ding)方法(fa)(fa)作為此類(lei)試劑臨床試驗(yan)研究的(de)(de)參比方法(fa)(fa)，驗(yan)證考(kao)核(he)試劑檢測結(jie)(jie)果與核(he)酸序列(lie)測定(ding)結(jie)(jie)果之(zhi)間的(de)(de)一致性(xing)情況。臨床研究報(bao)告(gao)中應對選用的(de)(de)測序方法(fa)(fa)做詳細介紹(shao)，包括測序儀型號、相關引(yin)物設計、性(xing)能(neng)驗(yan)證和(he)測序方法(fa)(fa)的(de)(de)質量控(kong)制等(deng)資料，以(yi)及提供測序服務的(de)(de)機構介紹(shao)和(he)選擇依據(ju)等(deng)。
（3） 此外，在充分考(kao)慮(lv)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)結果(guo)具有(you)(you)明確可(ke)(ke)比性(xing)(xing)的前提下，也可(ke)(ke)以選擇熒光原位雜交（FISH）或(huo)(huo)免疫組化等染色體或(huo)(huo)蛋白水平的檢(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)技術(shu)作(zuo)為參比方法，但考(kao)慮(lv)到檢(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)結果(guo)之間不具有(you)(you)直(zhi)接的可(ke)(ke)比性(xing)(xing)，建(jian)議對所有(you)(you)陽(yang)性(xing)(xing)病例(li)采用其他分子生(sheng)物學技術(shu)（如核酸序列測(ce)(ce)(ce)(ce)定）對結果(guo)予以確認。
2. 臨床研究單(dan)位的(de)選(xuan)擇(ze)
建議申請人在(zai)(zai)選擇臨(lin)床單(dan)(dan)位時，應(ying)在(zai)(zai)國內不同(tong)區域選擇臨(lin)床單(dan)(dan)位，盡量使各單(dan)(dan)位的(de)臨(lin)床樣(yang)本有(you)(you)一定(ding)的(de)區域代表(biao)性；臨(lin)床研究單(dan)(dan)位應(ying)具有(you)(you)分(fen)子病理診斷和(he)分(fen)子生物學方(fang)法檢測(ce)的(de)優勢，實(shi)驗操作人員(yuan)應(ying)有(you)(you)足(zu)夠的(de)時間熟悉檢測(ce)系統的(de)各環節（儀器(qi)、試(shi)劑、質控及操作程序等），熟悉評價(jia)方(fang)案。在(zai)(zai)整個實(shi)驗中，考核試(shi)劑和(he)參比方(fang)法都應(ying)處(chu)于有(you)(you)效的(de)質量控制下(xia)，最大限度保證試驗數(shu)據的準確(que)性及可重復性。
3. 臨床試(shi)驗(yan)方案(an)
臨(lin)(lin)床試(shi)驗(yan)(yan)(yan)實(shi)(shi)施(shi)前，研(yan)究(jiu)(jiu)人(ren)員(yuan)應從(cong)流行病學、統計學、臨(lin)(lin)床醫學、檢驗(yan)(yan)(yan)醫學等多方面(mian)考慮，設計科學合理的(de)(de)(de)臨(lin)(lin)床研(yan)究(jiu)(jiu)方案。各臨(lin)(lin)床研(yan)究(jiu)(jiu)機(ji)構的(de)(de)(de)方案設置應基本一致(zhi)，且保證在整個臨(lin)(lin)床試(shi)驗(yan)(yan)(yan)過程(cheng)(cheng)中遵循預定的(de)(de)(de)方案實(shi)(shi)施(shi)，不可隨(sui)意(yi)改(gai)動。整個試(shi)驗(yan)(yan)(yan)過程(cheng)(cheng)應在臨(lin)(lin)床研(yan)究(jiu)(jiu)機(ji)構的(de)(de)(de)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)室內并(bing)由(you)本實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)室的(de)(de)(de)技(ji)術人(ren)員(yuan)操作完成，申(shen)報單(dan)位的(de)(de)(de)技(ji)術人(ren)員(yuan)除進行必(bi)要的(de)(de)(de)技(ji)術指導外，不得隨(sui)意(yi)干涉實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)進程(cheng)(cheng)，尤其是數(shu)據收集過程(cheng)(cheng)。
試驗方(fang)案中(zhong)應(ying)(ying)(ying)確(que)定嚴格(ge)的(de)病(bing)例納入/排除標準，任何已(yi)經入選的(de)病(bing)例再被排除出臨(lin)床(chuang)研究都應(ying)(ying)(ying)記錄在案并明確(que)說明原因(yin)。在試驗操(cao)作過程中(zhong)和判定試驗結果時(shi)應(ying)(ying)(ying)采(cai)用(yong)盲法以保證(zheng)(zheng)試驗結果的(de)客觀性。各研究單位選用(yong)的(de)參比試劑應(ying)(ying)(ying)完全一致，以便進(jin)行(xing)合(he)理(li)的(de)統(tong)計學分(fen)析。臨(lin)床(chuang)方(fang)案中(zhong)還應(ying)(ying)(ying)明確(que)確(que)證(zheng)(zheng)試劑及方(fang)法。另外，考(kao)核試劑適(shi)用(yong)的(de)樣(yang)本類(lei)(lei)型(xing)、可(ke)檢(jian)測(ce)的(de)基(ji)因(yin)突變類(lei)(lei)型(xing)不應(ying)(ying)(ying)超(chao)越(yue)參比試劑的(de)相應(ying)(ying)(ying)檢(jian)測(ce)要求，若此(ci)種情況發生，則應(ying)(ying)(ying)選擇其他合(he)理(li)方(fang)法對額(e)外的(de)樣(yang)本類(lei)(lei)型(xing)和基(ji)因(yin)突變類(lei)(lei)型(xing)進(jin)行(xing)驗證(zheng)(zheng)。
4. 病例選擇及陽性病例比(bi)例
臨床試驗應(ying)以腫(zhong)瘤患者(zhe)為(wei)研(yan)究對象，其中試劑(ji)盒規定(ding)范圍的(de)每種突變類型(xing)均應(ying)有一定(ding)量的(de)陽(yang)性病(bing)例(li)。對于陰(yin)性病(bing)例(li)的(de)選(xuan)擇，也應(ying)考慮(lv)到交叉反應(ying)的(de)需要，以從臨床角度考察其分析特異性。陰(yin)/陽(yang)性病(bing)例(li)均應(ying)覆蓋所有適用的(de)腫(zhong)瘤類型(xing)。若(ruo)產(chan)品適用于多(duo)種樣本類型(xing)，則應(ying)對所有樣本類型(xing)均進行臨床驗證。
5. 統(tong)計學分析
對(dui)臨(lin)床試(shi)(shi)驗結果(guo)的統計應(ying)選(xuan)擇合(he)適(shi)的統計方法，如檢(jian)測(ce)結果(guo)一致性分析、受試(shi)(shi)者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合(he)率等。對(dui)于本(ben)類產(chan)品對(dui)比實(shi)驗的等效性研(yan)究，常選(xuan)擇交(jiao)叉四格表的形式總結兩(liang)種試(shi)(shi)劑(ji)(ji)的定性檢(jian)測(ce)結果(guo)，對(dui)定性結果(guo)進行四格表χ2檢(jian)驗或kappa檢(jian)驗以驗證(zheng)兩(liang)種試(shi)(shi)劑(ji)(ji)定性結果(guo)的一致性，統計分析應(ying)可以證(zheng)明兩(liang)種方法的檢(jian)測(ce)結果(guo)有無(wu)明顯統計學差異。在臨(lin)床研(yan)究方案中應(ying)明確統計檢(jian)驗假設，即評價考核試(shi)(shi)劑(ji)(ji)與(yu)參(can)比試(shi)(shi)劑(ji)(ji)是(shi)否等效的標(biao)準。
6. 結果差異樣本的(de)驗證
在數據收集過程中(zhong)，對于兩(liang)種方法檢測結(jie)果不一致的樣本，應采用(yong)“金標準”方法或臨(lin)床上普遍(bian)認為質(zhi)量較好的第三種同類試劑進行(xing)復核，同時結(jie)合患(huan)者(zhe)的臨(lin)床病情對差異原因(yin)及可能結(jie)果進行(xing)分析。
7. 臨床(chuang)試驗總結報(bao)告撰(zhuan)寫
根據(ju)《體外(wai)診(zhen)斷試(shi)劑臨(lin)床研究技術(shu)指導原則》的要(yao)求，臨(lin)床試(shi)驗(yan)(yan)報告(gao)應該對(dui)試(shi)驗(yan)(yan)的整體設計(ji)及各個關(guan)鍵(jian)點給予(yu)清(qing)晰(xi)、完(wan)整的闡(chan)述，應該對(dui)整個臨(lin)床試(shi)驗(yan)(yan)實施過程(cheng)、結果(guo)分析(xi)、結論等進行條理分明的描述，并應包(bao)括必(bi)要(yao)的基礎數據(ju)和(he)統計(ji)分析(xi)方法。建議在臨(lin)床總(zong)結報告(gao)中對(dui)以(yi)下內容進行詳述。
（1） 臨床試驗總體設計及方案描述
①臨(lin)(lin)床試(shi)驗的(de)整體(ti)管理情況、臨(lin)(lin)床研究單位選擇、臨(lin)(lin)床主(zhu)要研究人員簡介等基本情況介紹。
②病例(li)納入(ru)/排除(chu)標準、不同年齡段人(ren)群的(de)預期選(xuan)擇例(li)數及標準。
③樣本類型，樣本的(de)收集、處理及保(bao)存(cun)等(deng)。
④統計學(xue)方法(fa)、統計軟件、評(ping)價統計結(jie)果的標準。
（2） 具體的(de)臨床試驗情況
①臨床研究(jiu)所用產(chan)品的(de)名稱(cheng)、批號、有效期(qi)及所用機型等(deng)信息，以及對比試驗產(chan)品的(de)注冊情況。
②對各研究單位的病例(li)數(shu)、年齡分布情況進行綜合分析，建議(yi)以列表或圖示方式給出具體(ti)例(li)數(shu)及百分比。
③質(zhi)量(liang)(liang)控制，試驗人員(yuan)培訓(xun)、儀(yi)器日常維護、質(zhi)控品運行情(qing)況(kuang)，對檢(jian)測精密度、質(zhi)控品測量(liang)(liang)值的(de)抽查(cha)結(jie)果評估(gu)。
④具體試驗(yan)過(guo)程，樣本(ben)(ben)檢測、數據收集、樣本(ben)(ben)長期保存、結果(guo)不一致樣本(ben)(ben)的校驗(yan)等(deng)。
（3） 統計學分析(xi)
①數據(ju)預(yu)處理、差異數據(ju)的(de)重新檢測或第(di)三方(fang)驗證(zheng)以及是否(fou)納入最終數據(ju)統(tong)計、對異常值或缺失值的(de)處理、研(yan)究(jiu)過程中是否(fou)涉及對方(fang)案的(de)修改。
②陽性(xing)符合率、陰性(xing)符合率、總體符合率。
③以交叉四(si)格表的形式總結兩種(zhong)試劑的定(ding)性(xing)檢(jian)(jian)測(ce)結果，對定(ding)性(xing)結果進行四(si)格表χ2檢(jian)(jian)驗(yan)或kappa檢(jian)(jian)驗(yan)以驗(yan)證兩種(zhong)試劑定(ding)性(xing)結果的一(yi)致性(xing)。
另(ling)外考慮到對不同樣(yang)本類型(xing)以及(ji)(ji)不同年(nian)齡段(duan)人群的(de)檢測結(jie)果(guo)可能存在一定差異，故(gu)建議對不同樣(yang)本類型(xing)及(ji)(ji)不同年(nian)齡段(duan)人群分別進(jin)(jin)行統(tong)計分析(xi)，以對考核試劑的(de)臨床性能進(jin)(jin)行綜合分析(xi)。
（4） 討(tao)論和結(jie)論
對總體結(jie)果進行(xing)總結(jie)性描述(shu)并簡要分(fen)析試驗結(jie)果，對本次臨(lin)床(chuang)研究有無特別說(shuo)明，最后得出臨(lin)床(chuang)試驗結(jie)論(lun)。
1. 聚合酶鏈式(shi)反應 polymerase chain reaction, PCR：
聚(ju)合酶鏈式(shi)反(fan)應或多(duo)聚(ju)酶鏈式(shi)反(fan)應是一種對特定的DNA或RNA片段在體(ti)外(wai)進行快速(su)擴增的方法。由變性-退火-延伸三個基本反(fan)應步驟構(gou)成。
2. 雜交 hybridization
具(ju)有(you)一定(ding)同(tong)源序列(lie)的兩條核酸單(dan)鏈(lian)（DNA或RNA）可(ke)以通過氫鍵的方式，按堿基(ji)互補配對原則(ze)相結合(he)。
3. 熒(ying)光探針PCR
在PCR過程中(zhong)利用熒光(guang)染料(liao)釋(shi)放(fang)的(de)熒光(guang)能量(liang)的(de)變化(hua)直接反映出PCR擴增產物量(liang)的(de)變化(hua)，并通過對(dui)熒光(guang)的(de)采集和分(fen)(fen)析(xi)以達到對(dui)原(yuan)始模(mo)板量(liang)進行分(fen)(fen)析(xi)的(de)PCR。
4. 分析特異性(xing) analytical specificity
測(ce)量(liang)(liang)(liang)程序只測(ce)量(liang)(liang)(liang)被(bei)測(ce)量(liang)(liang)(liang)物(wu)(wu)的能力(li)。分(fen)析特異性用(yong)于描(miao)述檢測(ce)程序在(zai)(zai)(zai)樣本中有其(qi)他物(wu)(wu)質(zhi)存在(zai)(zai)(zai)時只測(ce)量(liang)(liang)(liang)被(bei)測(ce)量(liang)(liang)(liang)物(wu)(wu)的能力(li)。通常(chang)以一個(ge)被(bei)評估(gu)的潛在(zai)(zai)(zai)干擾物(wu)(wu)清單來(lai)描(miao)述，并給出在(zai)(zai)(zai)特定醫(yi)學(xue)相(xiang)關(guan)濃度(du)值水(shui)平的分(fen)析干擾程度(du)。
注：潛(qian)在干擾物(wu)包括干擾物(wu)和(he)交叉反應物(wu)。
5. 精密度(du) precision
在規定條件下，相互(hu)獨(du)立的測(ce)試結果之間的一致程度(du)(du)。精密度(du)(du)的程度(du)(du)是用統計學方(fang)法得(de)到(dao)的測(ce)量(liang)不(bu)精密度(du)(du)的數字形(xing)式(shi)表示，如標準差(cha)（SD）和變異系數（CV）。
6. 檢測限 detection limit, limit of detection
樣品中以一定概率(lv)可(ke)被(bei)聲(sheng)明與零有差異(yi)的被(bei)測(ce)測(ce)量(liang)的最低(di)值(zhi)。
7. 閾(yu)值循(xun)環數 cycle threshold, Ct
實時(shi)監(jian)測(ce)擴(kuo)(kuo)增(zeng)過程(cheng)中，反應管內(nei)的(de)(de)(de)熒光(guang)信號到(dao)達指數(shu)擴(kuo)(kuo)增(zeng)時(shi)經歷(li)的(de)(de)(de)循(xun)環周期數(shu)。主(zhu)要的(de)(de)(de)計算方式是以(yi)擴(kuo)(kuo)增(zeng)過程(cheng)前3到(dao)15個循(xun)環的(de)(de)(de)熒光(guang)值(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)10倍標準差(cha)為閾(yu)值(zhi)(zhi)，當(dang)熒光(guang)值(zhi)(zhi)超過閾(yu)值(zhi)(zhi)時(shi)的(de)(de)(de)循(xun)環數(shu)則為閾(yu)值(zhi)(zhi)循(xun)環數(shu)（Ct）。
8. 突變 mutation
是細胞中DNA核苷酸序列(lie)發生了穩(wen)定的可遺傳的改變。
9. 內標 internal control
在同(tong)一(yi)反應管中(zhong)與(yu)靶(ba)序列(lie)共(gong)同(tong)擴增的(de)一(yi)段(duan)非靶(ba)序列(lie)分(fen)子(zi)，其(qi)目的(de)是鑒(jian)別儀器故障、試(shi)劑(ji)因(yin)素(su)、聚合酶活(huo)性因(yin)素(su)或樣本中(zhong)存在抑制物(wu)等造成的(de)結(jie)果不理(li)想的(de)原因(yin)。
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