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一、概述 長期毒性試驗（重復給藥毒性試驗）是藥物非臨床安全性評價的核心內容，它與急性毒性、生殖毒性以及致癌性等毒理學研究有著密切的聯系，是藥物從藥學研究進入臨床試驗的重要環節。 在藥物開發的過程中，長期毒性試驗的目的是通過重復給藥的動物試驗表征受試物的毒性作用，預測其可能對人體產生的不良反應，降低臨床試驗受試者和藥品上市后使用人群的用藥風險。具體包括以下五個方面：①預測受試物可能引起的臨床不良反應，包括不良反應的性質、程度、劑量－反應關系和時間－反應關系、可逆性等；②判斷受試物反復給藥的毒性靶器官或靶組織；③推測臨床試驗的起始劑量和重復用藥的安全劑量范圍；④提示臨床試驗中需重點監測的指標；⑤還可以為臨床試驗中的解毒或解救措施提供參考。必須強調的是，長期毒性試驗的最終目的是為臨床試驗和臨床用藥服務。 本指導原則旨在為長期毒性試驗提供技術參考，同時也希望能夠對藥品的技術審評工作提供幫助，促進藥品審評機構與藥品注冊申請人之間就長期毒性試驗達成更為廣泛的共識。 本指導原則為化學藥物長期毒性試驗的一般性原則，僅代表目前對于長期毒性試驗的基本認識，其中的內容不完全是進行藥物長期毒性試驗時必須完成的內容。具體藥物的長期毒性試驗應在本指導原則的基礎上，根據藥物的自身特點制訂試驗方案。 二、立題原則 藥物開發的背景和基礎研究資料各不相同，在進行長期毒性試驗之前應對藥物的已有資料進行綜合分析，判斷是否可以通過已有資料達到長期毒性試驗的目的，為臨床試驗和臨床用藥提供支持。原則上，如果已有資料尚不能達到長期毒性試驗的目的，從保證臨床用藥安全的角度就應該進行長期毒性試驗；反之，則可以不必進行長期毒性試驗。 三、基本原則 （一）試驗管理 根據《中華人民共和國藥品管理法》的規定，藥物的長期毒性試驗必須執行《藥物非臨床研究質量管理規范》。 （二）整體性 藥物的開發是一個連續的、漸進的系統工程，長期毒性試驗是藥物開發的一個有機組成部分。長期毒性試驗不能與藥效學、藥代動力學和其他毒理學研究割裂，試驗設計應充分考慮其他藥理毒理研究的試驗設計和研究結果。長期毒性試驗的結果應該力求與其他藥理毒理試驗結果互為印證、說明和補充。 （三）具體問題具體分析 長期毒性試驗的試驗設計應該在對受試物的認知基礎上，遵循“具體問題具體分析”的原則進行。試驗設計應根據化合物的結構特點和理化性質、同類化合物在國內或國外的臨床使用情況、臨床適應證和用藥人群、臨床用藥方案、相關的藥效學、藥代動力學和毒理學研究信息等綜合考慮。 （四）隨機、對照、重復 長期毒性試驗的試驗設計應遵循“隨機、對照、重復”的原則。 四、基本內容 （一）受試物 長期毒性試驗應采用制備工藝穩定、符合臨床試驗用質量標準規定的樣品。受試物應注明名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件及配制方法等，并附有研制單位的自檢報告。所用輔料、溶媒等應注明批號、規格和生產廠家，并符合試驗要求。 在藥物開發的過程中，若受試物的制備工藝發生可能影響其安全性的變化，應進行相應的安全性研究。 （二）實驗動物 1、實驗動物種屬或品系的選擇 一般化學藥物的長期毒性試驗采用兩種實驗動物，一種為嚙齒類，另一種為非嚙齒類。理想的動物應具有以下特點：①對受試物的生物轉化與人體相近；②對受試物敏感；③已有大量歷史對照數據。基于目前國內的現狀，在大多數長期毒性試驗開始時，尚無法判斷不同種系實驗動物和人體對受試物的生物轉化的一致性，通常以大鼠和Beagle犬或猴作為長期毒性試驗的實驗動物。某些特殊結構的受試物應選用特殊種屬或品系的動物進行長期毒性試驗，必要時，也可選用疾病模型動物進行試驗。鼓勵在長期毒性試驗前采用體外試驗體系對實驗動物的種屬或品系進行篩選。 2、實驗動物的質量控制 長期毒性試驗一般選擇正常、健康和未孕的動物，動物體重差異應在平均體重的20％之內。動物應符合國家有關規定的等級要求，來源、品系、遺傳背景清楚，并具有實驗動物質量合格證。 應根據研究期限的長短和受試物臨床應用的患者群確定動物的年齡。動物年齡應盡量一致，一般大鼠為6～9周齡，Beagle犬為6～12月齡。 3、實驗動物的性別和數量 一般情況下，長期毒性試驗中每個試驗組應使用相等數量的雌、雄動物。每組動物的數量應能夠滿足試驗結果的分析和評價的需要。一般大鼠為雌、雄各10～30只，Beagle犬或猴為雌、雄各3～6只。 （三）給藥方案 1、給藥劑量 長期毒性試驗一般至少設高、中、低三個劑量給藥組和一個溶媒（或輔料）對照組，必要時還需設立空白對照組或陽性對照組。因為理論上群體中毒性反應的發生率隨暴露量的增加而增加，所以高劑量原則上應使動物產生明顯的毒性反應，甚至出現個別動物死亡。低劑量原則上應高于動物藥效學試驗的等效劑量，并不使動物出現毒性反應。為考察毒性反應劑量-反應關系，應在高劑量和低劑量之間設立中劑量。 2、給藥途徑 原則上應與臨床用藥途徑一致，否則應說明原因。 3、給藥頻率 原則上長期毒性試驗中動物應每天給藥，給藥期限長（3個月或以上）的藥物每周至少應給藥6天。特殊類型的受試物由于其毒性特點和臨床給藥方案等原因，應根據具體藥物的特點設計給藥頻率。 4、給藥期限 長期毒性試驗的給藥期限通常與擬定的臨床療程、臨床適應證和用藥人群有關。 臨床單次用藥的藥物，給藥期限為2周的長期毒性試驗通常可支持其進行臨床試驗和生產。 臨床療程不超過2周的藥物，給藥期限為1個月的長期毒性試驗通常可支持其進行臨床試驗和生產。 臨床療程超過2周的藥物，可以在臨床前一次性進行支持其進入III期臨床試驗（及生產）的長期毒性試驗；也可以通過不同給藥期限的長期毒性試驗來分別支持其進入I期、II期或III期臨床試驗（及生產）。一般1個月的長期毒性試驗可支持用藥時間不超過2周的I期臨床試驗，其他情況詳見附錄（一）。 通過給藥期限較短的毒性研究獲得的信息，可以為給藥期限較長的毒性研究設計提供給藥劑量、給藥頻率等方面的參考；同時，臨床試驗中獲得的信息有助于給藥期限較長的動物毒性研究方案的設計，降低藥物開發的風險。 以不同給藥期限的長期毒性試驗來分別支持藥物進入I期、II期或III期臨床試驗（及生產）時，不同給藥期限的長期毒性試驗的內容應完整、規范，對結果的分析評價應科學、合理。 （四）檢測指標和檢測時間 長期毒性試驗必須檢測的指標詳見附錄二。除必需的檢測指標外，長期毒性試驗應根據受試物的特點，有針對性地增加相應的檢測指標。 試驗前，嚙齒類動物至少應進行5天的適應性觀察，非嚙齒類動物至少應馴養觀察1～2周，應對實驗動物進行外觀體征、行為活動、攝食量和體重檢查，非嚙齒類動物還至少應進行2次體溫、心電圖、血液學和血液生化學指標等的檢測。此外，實驗動物相關指標的歷史背景數據在長期毒性試驗中也具有重要的參考意義。 試驗期間，應對動物進行外觀體征、行為活動、攝食量、體重、糞便性狀、給藥局部反應、血液學指標、血液生化學指標等的觀測。非嚙齒類動物還應進行體溫、心電圖、眼科檢查和尿液分析。應根據試驗周期的長短和受試物的特點確定檢測時間和檢測次數。原則上應盡早發現毒性反應，并反映出觀測指標或參數的變化與給藥期限的關系。 給藥結束后，應對動物（除恢復期觀察動物）進行全面的大體解剖，主要臟器應稱重并計算臟器系數。組織病理學檢查對判斷動物的毒性靶器官或靶組織具有重要的意義，病理學檢查報告應經檢查者簽名和病理檢查單位蓋章，如發現有異常變化，應附有相應的組織病理學照片。非嚙齒類動物對照組和各給藥組主要臟器組織均應進行組織病理學檢查；嚙齒類動物對照組和高劑量給藥組動物，以及尸檢異常者應詳細檢查，如某一組織發生病理改變，其他劑量組動物該組織也應進行組織病理學檢查。 長期毒性試驗應在給藥結束后對部分動物進行恢復期觀察，以了解毒性反應的可逆程度和可能出現的延遲性毒性反應。應根據受試物的代謝動力學特點、靶器官或靶組織的毒性反應和恢復情況確定恢復期的長短。 （五）毒物代謝動力學 本指導原則中的毒物代謝動力學（簡稱毒代動力學）系指結合長期毒性試驗進行的考察藥物系統暴露的代謝動力學研究。毒代動力學可以描述實驗動物的系統暴露與暴露劑量、暴露時間和毒理學結果之間的關系。本指導原則中毒代動力學研究的主要目的在于解釋長期毒性試驗的結果。 毒代動力學試驗應選擇合適的時間點采樣測定，從而獲得藥時曲線下面積（AUC）、峰濃度（Cmax）、達峰時間（Tmax）等參數。某些藥物應結合藥物血漿蛋白結合率來評價系統暴露量。毒代動力學數據可以來自長期毒性試驗的全部動物，也可以來自部分動物。建議此部分動物應包括低、中、高劑量組的動物，以便估算高劑量藥物在動物體內的動力學過程是否屬非線性動力學過程。 鼓勵創新性藥物進行毒代動力學研究。 五、結果分析和評價 長期毒性試驗的最終目的在于預測人體可能出現的毒性反應。只有通過研究結果的科學分析和評價才能夠清楚描述動物的毒性反應，并推斷其與人體的相關性。長期毒性試驗結果的分析和評價是長期毒性試驗的必要組成部分，必須對研究結果進行科學和全面的分析和評價。 （一）研究結果的分析 分析長期毒性試驗結果的目的是判斷動物是否發生毒性反應，描述毒性反應的性質和程度（包括毒性起始時間、程度、持續時間以及可逆性等）和靶器官，確定安全范圍，并探討可能的毒性作用機制。 1、正確理解試驗數據的意義 在對長期毒性試驗結果進行分析時，應正確理解均值數據和單個數據的意義。嚙齒類動物長期毒性試驗中組均值的意義通常大于單個動物數據的意義，實驗室歷史背景數據和文獻數據可以為結果的分析提供參考。非嚙齒類動物數量少、個體差異大，因此單個動物的試驗數據往往具有重要的毒理學意義。此外，非嚙齒類動物試驗結果必須與給藥前數據、對照組數據和實驗室歷史背景數據進行多重比較，文獻數據參考價值有限。 在分析長期毒性試驗結果時應綜合考慮數據的統計學意義和生物學意義。正確利用統計學假設檢驗有助于確定試驗結果的生物學意義，但具有統計學意義并不一定代表具有生物學意義。在判斷生物學意義時應考慮到參數變化的劑量-反應關系、其他相關參數的改變，以及與歷史背景數據的比較。 此外，在對長期毒性試驗結果進行分析時，應對異常數據進行合理的解釋。 2、正確判斷毒性反應 給藥組和對照組之間檢測參數的差異可能來自于與受試物有關的毒性反應、動物對藥物的適應性改變或正常的生理波動。在分析試驗結果時，應關注參數變化的劑量－反應關系、組內動物的參數變化幅度和性別差異，同時綜合考慮多項毒理學指標的檢測結果，分析其中的關聯和作用機制，以正確判斷藥物的毒性反應。單個參數的變化往往并不足以判斷化合物是否引起毒性反應，可能需要進一步進行相關的研究。此外毒代動力學研究可以為毒性反應和毒性靶器官或靶組織的判斷提供重要的參考依據。 （二）動物毒性反應對于臨床試驗的意義 將長期毒性試驗結果外推至人體時，不可避免地會涉及到受試物在動物和人體內毒性反應之間的差異。首先，不同物種、同物種不同種屬或個體之間對于某一受試物的毒性反應可能存在差異；其次，由于在長期毒性試驗中通常采用較高的給藥劑量，受試物可能在動物體內呈非線性動力學代謝過程，從而導致與人體無關的毒性反應；另外，長期毒性試驗難以預測一些在人體中發生率較低的毒性反應或僅在小部分人群中出現的特異質反應；同時有些毒性反應目前在動物中難以檢測，如頭痛、頭昏、頭暈、腹脹、皮膚搔癢、視物模糊等。鑒于以上原因，動物長期毒性試驗的結果一般不會完全再現于人體臨床試驗。但如果沒有試驗或文獻依據證明受試物對動物的毒性反應與人體無關，在進行藥物評價時必須首先假設人最為敏感，長期毒性試驗中動物的毒性反應將會在臨床試驗中再現。 進行深入的作用機制研究將有助于判斷動物和人體毒性反應的相關性。 （三）綜合評價 長期毒性試驗是藥物非臨床安全性研究的有機組成部分，是藥物非臨床毒理學研究中綜合性最強、獲得信息最多和對臨床指導意義最大的一項毒理學研究。對其結果進行評價時，應結合受試物的藥學特點，藥效學、藥代動力學和其他毒理學研究的結果，以及已取得的臨床研究的結果，進行綜合評價。對于長期毒性試驗結果的評價最終應落實到受試物的臨床不良反應、臨床毒性靶器官或靶組織、安全范圍、臨床需重點檢測的指標，以及必要的臨床監護或解救措施。 六、結語 長期毒性試驗的試驗設計，以及對于結果的分析和評價都應圍繞其目的而進行。通過長期毒性試驗，應該能夠對于受試物的臨床不良反應、臨床毒性靶器官或靶組織、安全范圍、臨床需重點檢測的指標，以及必要的臨床監護或解救措施做出合理的預測和判斷。 七、參考文獻 1、Michael A. Dorato and Melvin E. Andersen. The Toxicological Assessment of Pharmaceutical and Biotechnology Products. A. Wallace Hays. Principles and Methods of Toxicology. The Fourth Edition. Philadelphia: Taylor & Francis, 2001. 243~283. 2、Nelson H. Wilson, Jerry F. Hardisty, etal. Short-Term, Subchronic, and Chronic Toxicology Studies. A. Wallace Hays. Principles and Methods of Toxicology. The Fourth Edition. Philadelphia: Taylor & Francis, 2001. 917~957. 3、化藥藥品重復給藥毒性研究指導原則（試行）. 國家藥品監督管理局，2001. 4、Non-clinical safety studies for the conduct of human trials for pharmaceuticals. ICH/M3, 1997. 5、Duration of chronic toxicity testing in animals (rodent and non-rodent toxicity testing). ICH/S4, 1998. 6、Note for Guidance for Repeated Dose Toxicity. EMEA，2000. 7、Carla L. Bregman , Rick R. Adler, Daniel G. Morton, etal. Recommended tissue list for histopathologic examination in repeat-dose toxicity and carcinogenicity studies: a proposal of the Society of Toxicologic Pathology ( STP ). Toxicol. 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注1：此表為分別支持臨床療程超過2周的藥物進行II期和III期臨床試驗的長期毒性試驗的給藥期限。 注2：表中長期毒性試驗給藥期限不包括恢復期。應根據具體情況設計恢復期（詳見“檢測指標和檢測時間”部分）。 （二）長期毒性試驗中必須檢測的指標 1、血液學指標
2、血液生化學指標
3、尿液分析指標
4、組織病理學檢查的臟器組織 長期毒性試驗中需稱重并計算臟器系數的器官：
長期毒性試驗中需進行組織病理學檢查的組織或器官：
注：*為嚙齒類動物可不進行組織病理學檢查的組織或器官。 九、著者 《化學藥物長期毒性試驗技術指導原則》課題研究組 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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