病毒(du)感染是危及人類(lei)健康和生(sheng)命的(de)疾病之一(yi)，目(mu)前已(yi)有很多抗病毒(du)藥物(wu)上市應(ying)用，但(dan)仍不能完全滿(man)足臨床治療的(de)需求。近年來國內外(wai)相關制藥企業不斷投入(ru)大量資金研發(fa)抗病毒(du)藥物(wu)，抗病毒(du)藥物(wu)的(de)注(zhu)冊(ce)申請也逐漸受到各方面(mian)的(de)關注(zhu)。
根據試(shi)驗(yan)數(shu)據撰寫的非臨床(chuang)(chuang)和(he)臨床(chuang)(chuang)病(bing)毒(du)學研究(jiu)(jiu)報(bao)告是(shi)審評抗(kang)病(bing)毒(du)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)的臨床(chuang)(chuang)試(shi)驗(yan)申(shen)(shen)請(qing)和(he)上市申(shen)(shen)請(qing)的重要(yao)資料。本指導(dao)原則旨在(zai)幫(bang)助研發抗(kang)病(bing)毒(du)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)或(huo)生物(wu)(wu)制品(例如：治(zhi)療性蛋白(bai)和(he)單克隆抗(kang)體)的申(shen)(shen)請(qing)人初(chu)步了解(jie)哪些非臨床(chuang)(chuang)和(he)臨床(chuang)(chuang)病(bing)毒(du)學研究(jiu)(jiu)數(shu)據對于抗(kang)病(bing)毒(du)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)或(huo)生物(wu)(wu)制品申(shen)(shen)報(bao)臨床(chuang)(chuang)試(shi)驗(yan)或(huo)申(shen)(shen)請(qing)上市是(shi)最關鍵的。
本(ben)指導原則主要關注非臨(lin)床和臨(lin)床病毒學(xue)研(yan)究報(bao)告，同時對需要收集和提交的耐藥性(xing)研(yan)究數據提出(chu)了建議。討論的主要問題包括：
l 明確(que)作用機制
l 確定(ding)所研究藥(yao)物特定(ding)的(de)抗(kang)病毒活性
l 評(ping)價所研究(jiu)藥(yao)(yao)物與(yu)其他(ta)可(ke)能合用(yong)的抗病(bing)毒藥(yao)(yao)之間發生相互(hu)作用(yong)的可(ke)能性
l 提供病毒對(dui)所研(yan)究藥物產生耐藥性的(de)研(yan)究數據
l 提供所研(yan)(yan)究藥物與(yu)已上(shang)市的其他相同(tong)作用靶(ba)點抗病毒藥物的交叉(cha)耐藥性的研(yan)(yan)究數(shu)據
二、背景
近年(nian)來(lai)，國(guo)內外在(zai)抗(kang)(kang)HIV-1藥(yao)物(wu)的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)方(fang)面積(ji)累了大量的(de)(de)(de)經驗，也取得了很多進展。因此，本指(zhi)導原(yuan)(yuan)則(ze)以抗(kang)(kang)HIV-1藥(yao)物(wu)為范例，介紹抗(kang)(kang)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)藥(yao)物(wu)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)學研(yan)究(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)一般原(yuan)(yuan)則(ze)。盡管不(bu)同病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)檢測方(fang)法和模型系統有(you)較大的(de)(de)(de)差異，但本指(zhi)導原(yuan)(yuan)則(ze)的(de)(de)(de)許(xu)多抗(kang)(kang)HIV藥(yao)物(wu)研(yan)發(fa)(fa)的(de)(de)(de)原(yuan)(yuan)則(ze)適用于治(zhi)療(liao)其他病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)感(gan)染(如乙型肝(gan)炎(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)、丙型肝(gan)炎(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)、單(dan)純皰疹病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)、帶狀皰疹病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)、流感(gan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)、鼻(bi)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)、巨細(xi)胞病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)及人乳頭瘤病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)等(deng)國(guo)內常(chang)見病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du))的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)藥(yao)物(wu)的(de)(de)(de)研(yan)發(fa)(fa)。病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)學領域(yu)研(yan)究(jiu)(jiu)發(fa)(fa)展日新月異，所(suo)以，當積(ji)累了新的(de)(de)(de)資料或出(chu)現相關(guan)需求時，我們(men)將(jiang)對本指(zhi)導原(yuan)(yuan)則(ze)進行修訂(ding)。
三(san)、非臨床病毒學(xue)研究(jiu)
非(fei)臨(lin)床(chuang)病毒學(xue)研(yan)究有助于(yu)在進(jin)行(xing)人體試驗前評價藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)有效性和安全性。建議(yi)申(shen)請人進(jin)行(xing)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)作(zuo)用機制、藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)在模型系統(tong)中的(de)(de)特定抗(kang)病毒活性的(de)(de)研(yan)究，并(bing)提供(gong)對藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)產生耐藥(yao)(yao)(yao)的(de)(de)病毒學(xue)數據。此外(wai)，臨(lin)床(chuang)上常(chang)將一種藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)與(yu)其(qi)(qi)他已上市的(de)(de)治療(liao)相(xiang)同適(shi)應(ying)癥的(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)聯合(he)使用，因此，最好通過體外(wai)試驗研(yan)究兩種或兩種以(yi)上藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)聯合(he)用藥(yao)(yao)(yao)的(de)(de)抗(kang)病毒活性，以(yi)便(bian)發(fa)現所研(yan)究藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)與(yu)其(qi)(qi)他抗(kang)病毒藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)之間可能存在的(de)(de)相(xiang)互作(zuo)用(如拮抗(kang)、協同、增強、疊加等)，尤其(qi)(qi)應(ying)關注(zhu)負面(mian)的(de)(de)相(xiang)互作(zuo)用。
由于已上(shang)市的抗病毒藥(yao)(yao)物(wu)(wu)很多(duo)，交(jiao)叉耐藥(yao)(yao)(病毒對(dui)一種藥(yao)(yao)物(wu)(wu)耐藥(yao)(yao)后，對(dui)同類的其他藥(yao)(yao)物(wu)(wu)也(ye)產(chan)生了耐藥(yao)(yao)性(xing))可能會(hui)成為臨床應(ying)用中的一個主要(yao)問題。因(yin)此，在抗病毒藥(yao)(yao)物(wu)(wu)的研發過程(cheng)中，下(xia)列信息顯得非常重要(yao)：
l 測定所研究藥(yao)(yao)物對相同作用靶點的(de)其他已(yi)上市藥(yao)(yao)物的(de)耐藥(yao)(yao)病毒(du)株(zhu)的(de)抗病毒(du)活性(xing)。
l 測定已上(shang)市藥物對由相同作用靶點的(de)所研(yan)究(jiu)藥物誘導的(de)耐藥病(bing)毒(du)株的(de)抗病(bing)毒(du)活性(xing)。
申請人在開始(shi)I期臨床試驗前(qian)應先進行非(fei)臨床研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(如(ru)作用(yong)機制研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)、體外抗病(bing)毒(du)活(huo)性研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)、耐藥(yao)性研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)，以及血清蛋白結合率對(dui)抗病(bing)毒(du)活(huo)性影響的研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)等)。
如(ru)果病(bing)(bing)毒有(you)合適的(de)體(ti)外(wai)感染模型系統(tong)，在開始旨在考(kao)察所(suo)研究藥(yao)物(wu)與其他(ta)抗病(bing)(bing)毒藥(yao)物(wu)合用(yong)(yong)療(liao)效的(de)臨床試驗前，申請人應完成所(suo)研究藥(yao)物(wu)與其他(ta)已(yi)上(shang)市的(de)針對此病(bing)(bing)毒藥(yao)物(wu)合用(yong)(yong)的(de)體(ti)外(wai)活性研究，如(ru)針對相(xiang)同靶點有(you)多種已(yi)上(shang)市的(de)藥(yao)物(wu)和研究藥(yao)物(wu)，應從每一(yi)類(lei)藥(yao)物(wu)中至少選一(yi)種有(you)代表性的(de)藥(yao)物(wu)進行研究。
在(zai)對(dui)感染某一種病毒的患者進行臨床(chuang)試驗(yan)前(qian)，應先(xian)通(tong)過體外試驗(yan)誘(you)導對(dui)所研(yan)究藥物(wu)耐藥的病毒株，并鑒定耐藥病毒株的表型(xing)和基因型(xing)及(ji)交叉耐藥性。
(一)作用機制研究
在(zai)I期(qi)臨床(chuang)試(shi)驗(yan)前應進行作用機制(zhi)研究。充(chong)分掌握(wo)藥(yao)物的(de)作用機制(zhi)對于臨床(chuang)試(shi)驗(yan)的(de)設(she)計非常重要，可(ke)使研究者了(le)解(jie)病毒基因組(zu)中發生(sheng)導致耐藥(yao)性(xing)突變的(de)可(ke)能(neng)區域(yu)，這些區域(yu)不僅限于所(suo)研究藥(yao)物作用的(de)靶位(病毒編碼的(de)靶點)，也可(ke)能(neng)包(bao)括酶的(de)底物或靶蛋(dan)白(bai)復(fu)合物中存在(zai)的(de)另外的(de)病毒或宿主編碼蛋(dan)白(bai)。耐藥(yao)性(xing)突變的(de)鑒(jian)定結果也可(ke)以為機制(zhi)研究和臨床(chuang)研究提供(gong)依(yi)據。
病(bing)毒生命(ming)周(zhou)期中(zhong)的(de)(de)許多階段(duan)都可(ke)以成為(wei)潛在的(de)(de)抗(kang)(kang)病(bing)毒藥物的(de)(de)作(zuo)(zuo)用靶點。藥物可(ke)以通過作(zuo)(zuo)用于病(bing)毒特異性的(de)(de)編碼功(gong)能而發(fa)揮(hui)直接的(de)(de)抗(kang)(kang)病(bing)毒作(zuo)(zuo)用(如(ru)酶抑制(zhi)劑)，或者通過其他途徑而發(fa)揮(hui)間接的(de)(de)抗(kang)(kang)病(bing)毒作(zuo)(zuo)用(如(ru)干(gan)擾素誘(you)導的(de)(de)宿主細胞應答(da))。建議進(jin)行如(ru)下作(zuo)(zuo)用機(ji)制(zhi)研究(jiu)：
l 證明(ming)藥物具有特(te)異性地抑(yi)制(zhi)(zhi)病毒復(fu)制(zhi)(zhi)或抑(yi)制(zhi)(zhi)病毒特(te)定功能(neng)的能(neng)力(li)。
l 確定藥物作用的(de)(de)靶點(如病毒(du)(du)復制(zhi)(zhi)酶、蛋白酶等(deng))或作用于病毒(du)(du)復制(zhi)(zhi)的(de)(de)哪個階(jie)段(如病毒(du)(du)進(jin)入、入核等(deng))。
申請人可提(ti)供支持其藥物(wu)作用機制(zhi)的(de)生物(wu)化學(xue)、結(jie)構學(xue)、細胞學(xue)、遺傳(chuan)學(xue)等方面的(de)數據(ju)。證(zheng)明藥物(wu)作用機制(zhi)的(de)數據(ju)包(bao)括但不僅(jin)限于受(shou)體結(jie)合(he)、抑(yi)制(zhi)酶活性、確定(ding)抑(yi)制(zhi)劑與(yu)受(shou)體復合(he)物(wu)結(jie)合(he)的(de)X-光晶體結(jie)構、編碼靶蛋白(bai)基因的(de)耐藥性突變位點的(de)鑒(jian)定(ding)等。
應比(bi)較所研(yan)究藥(yao)物對病(bing)(bing)(bing)毒靶點(dian)及(ji)細胞或(huo)宿(su)主蛋白(bai)作用(yong)的選擇性(xing)，當宿(su)主細胞中(zhong)存在或(huo)可(ke)能存在與(yu)病(bing)(bing)(bing)毒酶(mei)(mei)類似的酶(mei)(mei)時(shi)，此點(dian)尤(you)其重(zhong)要(yao)。例如(ru)，如(ru)果(guo)藥(yao)物的作用(yong)靶點(dian)是病(bing)(bing)(bing)毒聚(ju)合(he)酶(mei)(mei)，建議申請人證明(ming)該(gai)藥(yao)物對病(bing)(bing)(bing)毒聚(ju)合(he)酶(mei)(mei)的抑制活(huo)性(xing)，同時(shi)比(bi)較其對宿(su)主細胞的DNA聚(ju)合(he)酶(mei)(mei)(如(ru)DNA聚(ju)合(he)酶(mei)(mei)α、β及(ji)γ)的抑制活(huo)性(xing)。
研發免(mian)疫(yi)調節劑還應(ying)注(zhu)意更多(duo)問題。此(ci)類(lei)藥物會對機體的(de)免(mian)疫(yi)系統(tong)產生(sheng)作(zuo)(zuo)用(yong)，因而可能(neng)會對病毒的(de)復制(zhi)起不到抑制(zhi)作(zuo)(zuo)用(yong)，或者對機體產生(sheng)其他(ta)不良影響。對于通過刺激全身免(mian)疫(yi)反應(ying)而發揮作(zuo)(zuo)用(yong)的(de)免(mian)疫(yi)調節劑，建議申請(qing)人證實其抗(kang)病毒活(huo)性，并鑒定(ding)出(chu)參與作(zuo)(zuo)用(yong)的(de)免(mian)疫(yi)分子或免(mian)疫(yi)細胞。
(二(er))抗病(bing)毒活性
1.體外抗病毒活性
許多感(gan)染人體(ti)(ti)的(de)(de)病(bing)(bing)毒可(ke)以(yi)在細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)系統或(huo)動物(wu)宿主(zhu)體(ti)(ti)內(nei)完成完整的(de)(de)生命周期(qi)。在這(zhe)樣的(de)(de)情況(kuang)下(xia)，建(jian)議(yi)申請(qing)人在開始I期(qi)臨(lin)床(chuang)試驗(yan)前先(xian)通過體(ti)(ti)外試驗(yan)證明(ming)所(suo)研究藥物(wu)和(he)/或(huo)其代謝產(chan)物(wu)的(de)(de)特異的(de)(de)、可(ke)定量(liang)的(de)(de)抗(kang)病(bing)(bing)毒活性。這(zhe)些數(shu)據應(ying)能清楚地證明(ming)在體(ti)(ti)內(nei)、在可(ke)接受的(de)(de)風險/收益比的(de)(de)情況(kuang)下(xia)達到的(de)(de)藥物(wu)濃度(du)具有抗(kang)病(bing)(bing)毒作用，從而(er)為人體(ti)(ti)試驗(yan)提(ti)供支(zhi)持，這(zhe)一(yi)點非常重(zhong)要。此外，使用相關的(de)(de)細(xi)胞(bao)和(he)病(bing)(bing)毒臨(lin)床(chuang)分(fen)離株進行的(de)(de)體(ti)(ti)外抗(kang)病(bing)(bing)毒活性和(he)細(xi)胞(bao)毒性評(ping)價[見第三部分(fen)(三)細(xi)胞(bao)毒性和(he)治(zhi)療指數(shu)]可(ke)以(yi)指導早(zao)期(qi)臨(lin)床(chuang)試驗(yan)選(xuan)擇(ze)合適的(de)(de)劑量(liang)范圍。
鼓勵申(shen)請人(ren)(ren)使(shi)用(yong)人(ren)(ren)靶細(xi)胞的原代培養(yang)細(xi)胞進行抗(kang)(kang)病(bing)(bing)毒(du)(du)活(huo)(huo)性研究(jiu)。由(you)于(yu)病(bing)(bing)毒(du)(du)的基因容易(yi)發生變異，所(suo)以應(ying)(ying)使(shi)用(yong)多種臨(lin)(lin)床(chuang)(chuang)分(fen)(fen)離株考察所(suo)研究(jiu)藥物的抗(kang)(kang)病(bing)(bing)毒(du)(du)活(huo)(huo)性，臨(lin)(lin)床(chuang)(chuang)分(fen)(fen)離株應(ying)(ying)能代表臨(lin)(lin)床(chuang)(chuang)試驗中的病(bing)(bing)毒(du)(du)群。建(jian)議進行的抗(kang)(kang)病(bing)(bing)毒(du)(du)活(huo)(huo)性研究(jiu)包(bao)括：
l 評價(jia)所研(yan)究藥(yao)物對一(yi)系列病毒(du)實(shi)驗室適應株和(he)臨床分離株(包括不同的亞群(clades)、亞型(subtypes)或基因(yin)型(genotypes))的特異性(xing)抗病毒(du)活性(xing)。
l 評價所研究(jiu)藥(yao)(yao)物(wu)對相同作(zuo)用靶(ba)位或復合物(wu)藥(yao)(yao)物(wu)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)的(de)病毒(du)株(zhu)、對其他已(yi)上市具有(you)相同適應癥的(de)藥(yao)(yao)物(wu)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)的(de)代表性(xing)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)病毒(du)株(zhu)的(de)抗病毒(du)活性(xing)。
應(ying)使(shi)用定量的(de)(de)檢測方(fang)法，在不同濃度(du)藥物的(de)(de)條(tiao)件下測定病毒的(de)(de)復制(zhi)，并與不添加藥物的(de)(de)測定結果(guo)進行比(bi)較，確定藥物的(de)(de)劑量依賴(lai)的(de)(de)特異性抗病毒活性。
藥(yao)物的(de)有(you)效(xiao)濃度(du)是指(zhi)使病(bing)(bing)毒(du)復制(zhi)的(de)水平降低(di)50%的(de)濃度(du)(細(xi)(xi)胞培養試驗中用(yong)EC50表示(shi)，生物化學或(huo)亞(ya)細(xi)(xi)胞試驗中用(yong)IC50表示(shi))。評(ping)價藥(yao)物的(de)抗病(bing)(bing)毒(du)活性和細(xi)(xi)胞毒(du)性的(de)方(fang)法包(bao)括(kuo)但不局限于病(bing)(bing)毒(du)滅活試驗、空斑減(jian)數試驗、細(xi)(xi)胞病(bing)(bing)變效(xiao)應抑制(zhi)試驗、病(bing)(bing)毒(du)抗原或(huo)核酸檢(jian)測(ce)、感染(ran)性病(bing)(bing)毒(du)顆粒檢(jian)測(ce)、含報告基因的(de)病(bing)(bing)毒(du)或(huo)細(xi)(xi)胞檢(jian)測(ce)等。可能影響這(zhe)些試驗的(de)因素包(bao)括(kuo)病(bing)(bing)毒(du)感染(ran)復數(Multiplicity of Infection，MOI)和給(gei)藥(yao)時間(jian)(jian)(如病(bing)(bing)毒(du)感染(ran)前給(gei)藥(yao)或(huo)感染(ran)后(hou)不同時間(jian)(jian)給(gei)藥(yao))。建(jian)議申請人(ren)使用(yong)傳代次數較少(shao)的(de)宿主細(xi)(xi)胞進行研究(jiu)。
藥(yao)物的(de)有效濃度(du)與(yu)作(zuo)(zuo)用機制研究的(de)數據(ju)(ju)應一致，如果(guo)藥(yao)物抑制病(bing)毒復制所需的(de)濃度(du)低于(yu)(yu)根(gen)據(ju)(ju)假定(ding)的(de)作(zuo)(zuo)用機制計算出的(de)生(sheng)(sheng)化(hua)數據(ju)(ju)，則提(ti)示(shi)可(ke)能還存在(zai)其他(ta)的(de)作(zuo)(zuo)用位(wei)點或機制。當抗病(bing)毒活(huo)性數據(ju)(ju)與(yu)生(sheng)(sheng)化(hua)數據(ju)(ju)不一致時，可(ke)以通過耐藥(yao)性分(fen)析證(zheng)明藥(yao)物在(zai)體內的(de)作(zuo)(zuo)用機制。對于(yu)(yu)核苷(gan)或核苷(gan)酸(suan)類似物，建議在(zai)細胞(bao)的(de)穩(wen)定(ding)期及分(fen)裂期測定(ding)藥(yao)物活(huo)性分(fen)子的(de)三磷(lin)酸(suan)鹽的(de)半衰期(t1/2)。
某些影響人類(lei)健康(kang)的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)(如乙型(xing)(xing)肝(gan)(gan)炎病(bing)毒(du)和(he)丙(bing)型(xing)(xing)肝(gan)(gan)炎病(bing)毒(du)等)目(mu)前(qian)尚無合適(shi)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)培養系(xi)統(tong)或(huo)動物模型(xing)(xing)。對于(yu)此類(lei)病(bing)毒(du)，可(ke)以通過對親緣(yuan)關系(xi)很近的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)關鍵功能和(he)活性的(de)(de)(de)抑制(zhi)(zhi)揭示藥(yao)物的(de)(de)(de)潛在抗病(bing)毒(du)活性。如果(guo)目(mu)標病(bing)毒(du)目(mu)前(qian)尚無合適(shi)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)培養系(xi)統(tong)或(huo)動物模型(xing)(xing)，而且藥(yao)物的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)部(bu)位被認(ren)為(wei)位于(yu)細(xi)胞(bao)內、細(xi)胞(bao)內的(de)(de)(de)藥(yao)物濃度與生化研(yan)究(jiu)中的(de)(de)(de)結果(guo)一致時，確定抗病(bing)毒(du)藥(yao)物的(de)(de)(de)活性部(bu)分能否進入細(xi)胞(bao)內尤(you)為(wei)重要。目(mu)前(qian)用(yong)于(yu)研(yan)究(jiu)乙型(xing)(xing)肝(gan)(gan)炎病(bing)毒(du)(HBV)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)系(xi)和(he)基(ji)(ji)于(yu)細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)檢測方法還(huan)非常有限。研(yan)究(jiu)丙(bing)型(xing)(xing)肝(gan)(gan)炎病(bing)毒(du)(HCV)進入、復制(zhi)(zhi)和(he)感(gan)染(ran)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)于(yu)細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)試(shi)驗取得(de)了一定進展，但還(huan)存在很多不(bu)足。
目(mu)前(qian)用于檢(jian)測(ce)HBV復制的方法包括但不限(xian)于：
l 通(tong)過生(sheng)物化學試驗測定(ding)HBV DNA聚合酶的活性(xing)。
l 使用桿狀病毒(du)介導的轉入或轉染HBV基因組(zu)到人肝細胞株進行細胞培養試(shi)驗，然后用HBV DNA探針經Southern Blot定量(liang)分析檢測HBV cccDNA及RI-DNA等的形成。
l 用含(han)有HBV基因組(zu)(復(fu)制可調控或(huo)不可調控)的穩定轉染細胞(bao)株進(jin)行細胞(bao)培養試驗。
l 采(cai)用(yong)定量PCR法測(ce)量細胞外的HBV DNA。
對(dui)于(yu)(yu)HCV,目(mu)前有用(yong)于(yu)(yu)研(yan)究病毒(du)進入(ru)(或受體)的(de)(de)假病毒(du)系(xi)(xi)統(tong)(tong)(HCVpp)、研(yan)究病毒(du)復制(zhi)(zhi)的(de)(de)復制(zhi)(zhi)子系(xi)(xi)統(tong)(tong)(Replicon)以(yi)及(ji)研(yan)究完整病毒(du)復制(zhi)(zhi)周期的(de)(de)病毒(du)感染系(xi)(xi)統(tong)(tong)(HCVcc)，這些系(xi)(xi)統(tong)(tong)均(jun)可用(yong)于(yu)(yu)評價藥物對(dui)HCV的(de)(de)抗(kang)病毒(du)活(huo)性(xing)。遺憾(han)的(de)(de)是(shi)HCVcc系(xi)(xi)統(tong)(tong)目(mu)前僅在2a亞型中取得成功。目(mu)前用(yong)于(yu)(yu)評價藥物抗(kang)HCV活(huo)性(xing)的(de)(de)方法包括但不局(ju)限于(yu)(yu)：
l 體外檢測(ce)藥物(wu)對病毒靶標蛋白(HCV RNA聚合酶、HCV絲氨酸蛋白酶)的抑制活性(xing)。
l 采用(yong)不(bu)同亞型(xing)復(fu)(fu)制子系統(tong)評(ping)價藥物對不(bu)同亞型(xing)HCV復(fu)(fu)制的抑制作用(yong)。通過報告基因檢測病毒抗原的表達水(shui)平(ping)，或通過RT-PCR檢測HCV復(fu)(fu)制子細(xi)胞(bao)中(zhong)HCV RNA的水(shui)平(ping)。
l 在HCVcc系(xi)統中(zhong)，通過(guo)檢(jian)(jian)測病毒(du)中(zhong)報告基因編碼產物(如熒(ying)光(guang)素酶或綠色熒(ying)光(guang)蛋(dan)白等(deng))的(de)(de)活(huo)性反映(ying)藥物對病毒(du)的(de)(de)抑制作用。也可以通過(guo)RT-PCR檢(jian)(jian)測HCV復制子(zi)細胞中(zhong)HCV RNA的(de)(de)拷貝(bei)數，或定量檢(jian)(jian)測病毒(du)抗原水平。
2.血清蛋白存在條件下的體外抗(kang)病毒(du)活性
血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)蛋(dan)白(bai)能(neng)與許多藥(yao)(yao)(yao)物結(jie)(jie)合(he)或螯合(he)，從而影響(xiang)藥(yao)(yao)(yao)物的(de)(de)抗病毒(du)(du)活性。建(jian)議(yi)申請(qing)人(ren)詳細考察藥(yao)(yao)(yao)物是否能(neng)與血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)蛋(dan)白(bai)顯著(zhu)結(jie)(jie)合(he)。測定藥(yao)(yao)(yao)物血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)蛋(dan)白(bai)結(jie)(jie)合(he)率(lv)的(de)(de)常用方法(fa)包括平衡透析法(fa)、超濾法(fa)以及基于熒(ying)光技術的(de)(de)高(gao)通量(liang)人(ren)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)白(bai)蛋(dan)白(bai)和α-酸性糖蛋(dan)白(bai)結(jie)(jie)合(he)試驗。如(ru)果(guo)藥(yao)(yao)(yao)物的(de)(de)蛋(dan)白(bai)結(jie)(jie)合(he)率(lv)較高(gao)，則(ze)建(jian)議(yi)申請(qing)人(ren)在(zai)加入系列人(ren)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)稀釋液(如(ru)5%、10%、20%、40%)條件(jian)(jian)下測定藥(yao)(yao)(yao)物的(de)(de)體(ti)外抗病毒(du)(du)活性。通過這些數據可(ke)以推(tui)算出藥(yao)(yao)(yao)物在(zai)100%人(ren)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)中的(de)(de)EC50，同時應報(bao)告血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)校(xiao)正后的(de)(de)EC50值。此(ci)外，建(jian)議(yi)申請(qing)人(ren)在(zai)含(han)有生理濃度的(de)(de)α-酸性糖蛋(dan)白(bai)和人(ren)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)白(bai)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)條件(jian)(jian)下測定藥(yao)(yao)(yao)物的(de)(de)EC50值。
3.抑(yi)制指數
血(xue)漿藥(yao)(yao)(yao)物(wu)濃(nong)度(du)(du)和(he)細(xi)胞(bao)內藥(yao)(yao)(yao)物(wu)濃(nong)度(du)(du)對(dui)于評(ping)價抗病毒治療的(de)(de)(de)量(liang)(liang)效關(guan)系(xi)和(he)發生(sheng)耐藥(yao)(yao)(yao)的(de)(de)(de)可(ke)能性(xing)非常(chang)重要(yao)，計(ji)算抑(yi)制(zhi)指(zhi)數(shu)(Inhibitory Quotient，IQ)時(shi)也需要(yao)用到這些數(shu)據。抑(yi)制(zhi)指(zhi)數(shu)(IQ)等于Cmin除以血(xue)清(qing)校(xiao)正后的(de)(de)(de)EC50值(zhi)(zhi)。測定EC50值(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)更多信(xin)息可(ke)參(can)閱第(di)三(san)部分(二)第(di)1節(jie)-體(ti)外抗病毒活(huo)性(xing)。IQ值(zhi)(zhi)是(shi)(shi)一(yi)個(ge)綜合藥(yao)(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)(de)體(ti)內濃(nong)度(du)(du)和(he)抗病毒活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)有(you)用工具，也是(shi)(shi)描述藥(yao)(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)(de)暴(bao)露程度(du)(du)與病毒對(dui)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)敏(min)感性(xing)之間相互關(guan)系(xi)的(de)(de)(de)一(yi)個(ge)指(zhi)標。如果一(yi)種(zhong)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)(de)IQ較高(gao)，則表明患(huan)(huan)者(zhe)體(ti)內的(de)(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)能達到有(you)效抑(yi)制(zhi)病毒的(de)(de)(de)濃(nong)度(du)(du)，可(ke)使耐藥(yao)(yao)(yao)發生(sheng)的(de)(de)(de)概(gai)率降到最低。由于同一(yi)種(zhong)劑量(liang)(liang)可(ke)能并(bing)不(bu)適用于所有(you)的(de)(de)(de)患(huan)(huan)者(zhe)，所以IQ值(zhi)(zhi)也可(ke)以用于指(zhi)導(dao)III期(qi)和(he)IV期(qi)臨床試驗劑量(liang)(liang)的(de)(de)(de)選擇。
4.體(ti)內抗病毒活性
在體(ti)外抗病毒活性(xing)研究的(de)基礎上(shang)，可進一(yi)步通過動物(wu)感染(ran)模(mo)型來評價(jia)藥(yao)(yao)物(wu)的(de)抗病毒活性(xing)。動物(wu)模(mo)型的(de)分析指標包括病毒感染(ran)后(需要(yao)有(you)證(zheng)據證(zheng)明(ming))動物(wu)發(fa)病率(lv)和(he)死亡率(lv)、組織學(xue)檢查(cha)、各時間點的(de)病毒載量(liang)、在發(fa)生(sheng)病毒反彈的(de)動物(wu)體(ti)內耐藥(yao)(yao)株的(de)分離和(he)鑒定、病毒抗原(yuan)和(he)抗體(ti)的(de)定量(liang)檢測、藥(yao)(yao)代動力學(xue)數據以及(ji)癥(zheng)狀(zhuang)(如神(shen)經(jing)系統癥(zheng)狀(zhuang)、體(ti)重減少(shao)等(deng))。
(三(san))細胞毒性及治療指數
申請人應(ying)在臨床試驗(yan)前開(kai)展藥(yao)物(wu)細胞毒性和治(zhi)療指數的研(yan)究。需(xu)要證(zheng)明藥(yao)物(wu)在體內可達到的濃度下具有抗(kang)病毒活(huo)性，同時該濃度的藥(yao)物(wu)不會對細胞產(chan)生毒性作用。應(ying)排除測定的藥(yao)物(wu)抗(kang)病毒活(huo)性是由于宿主細胞死亡所造成的可能。這一(yi)點非常(chang)重要。
在細胞(bao)毒(du)(du)性(xing)試驗中，應(ying)設置抗病毒(du)(du)藥物的(de)(de)(de)(de)濃度(du)梯度(du)，測(ce)定導致50%的(de)(de)(de)(de)宿主細胞(bao)死亡的(de)(de)(de)(de)濃度(du)[參見(jian)第三部分(二(er))第1節-體外抗病毒(du)(du)活性(xing)]，即(ji)(ji)所(suo)研究藥物的(de)(de)(de)(de)半數(shu)(shu)細胞(bao)毒(du)(du)性(xing)濃度(du)，通常(chang)用(yong)CC50或(huo)CCIC50來(lai)表示(shi)。治(zhi)療(liao)指數(shu)(shu)或(huo)選擇性(xing)指數(shu)(shu)(即(ji)(ji)CC50/EC50)則是藥物的(de)(de)(de)(de)細胞(bao)毒(du)(du)性(xing)效應(ying)與抑制(zhi)病毒(du)(du)復制(zhi)效應(ying)的(de)(de)(de)(de)比(bi)值。理(li)想(xiang)的(de)(de)(de)(de)藥物應(ying)具有(you)最大(da)的(de)(de)(de)(de)抗病毒(du)(du)活性(xing)，同時(shi)具有(you)最小(xiao)的(de)(de)(de)(de)細胞(bao)毒(du)(du)性(xing)(即(ji)(ji)具有(you)較大(da)的(de)(de)(de)(de)治(zhi)療(liao)指數(shu)(shu))。
建議申請人(ren)對處于(yu)穩定(ding)(ding)期和(he)分裂期的各種類型(xing)(xing)的、相關的人(ren)細(xi)胞(bao)和(he)組織(zhi)細(xi)胞(bao)進行CC50值的測定(ding)(ding)，確定(ding)(ding)藥物對不(bu)(bu)同細(xi)胞(bao)周期、不(bu)(bu)同細(xi)胞(bao)類型(xing)(xing)或不(bu)(bu)同組織(zhi)的潛(qian)在毒性。
由于(yu)某些抗病(bing)(bing)毒藥物(wu)(wu)對(dui)骨(gu)髓有(you)抑制作用，建議申請(qing)人(ren)采用細(xi)(xi)胞(bao)集落(luo)形成(cheng)(cheng)(cheng)法(fa)評價(jia)某些藥物(wu)(wu)(如核苷類似(si)物(wu)(wu))對(dui)人(ren)骨(gu)髓祖細(xi)(xi)胞(bao)生長(chang)的(de)(de)潛在(zai)影響。此外，某些藥物(wu)(wu)也對(dui)負責(ze)正常細(xi)(xi)胞(bao)核DNA和(he)線(xian)(xian)(xian)粒(li)體(ti)DNA合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)及修復(fu)的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)DNA聚(ju)合(he)酶(mei)具有(you)潛在(zai)的(de)(de)抑制作用。申請(qing)人(ren)應(ying)測定抗病(bing)(bing)毒藥物(wu)(wu)對(dui)細(xi)(xi)胞(bao)聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)(de)IC50，同時(shi)應(ying)證明藥物(wu)(wu)對(dui)病(bing)(bing)毒靶點作用的(de)(de)特(te)異性(與對(dui)細(xi)(xi)胞(bao)聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)(de)作用相比)。人(ren)體(ti)的(de)(de)DNA聚(ju)合(he)酶(mei)γ負責(ze)線(xian)(xian)(xian)粒(li)體(ti)DNA合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)，人(ren)DNA聚(ju)合(he)酶(mei)γ被抑制與線(xian)(xian)(xian)粒(li)體(ti)功能缺損之間具有(you)相關性，并(bing)會導(dao)致人(ren)體(ti)不良反應(ying)的(de)(de)發(fa)生。因(yin)此，考察(cha)某些藥物(wu)(wu)(如核苷類似(si)物(wu)(wu))對(dui)人(ren)聚(ju)合(he)酶(mei)γ活性的(de)(de)影響以(yi)及對(dui)線(xian)(xian)(xian)粒(li)體(ti)的(de)(de)毒性作用(如乳(ru)酸的(de)(de)生成(cheng)(cheng)(cheng)量(liang)，線(xian)(xian)(xian)粒(li)體(ti)DNA含量(liang)、線(xian)(xian)(xian)粒(li)體(ti)形態學(xue)，葡萄糖利用率)就顯得(de)非常重要。
(四)體外聯(lian)合用藥的活(huo)性分析
感染病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)患者(zhe)體內可能(neng)(neng)存在(zai)不同(tong)(tong)的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)變異株，其中(zhong)某(mou)些(xie)類型的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)株可能(neng)(neng)對一種(zhong)或(huo)多種(zhong)抗(kang)病(bing)毒(du)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)具有耐藥(yao)(yao)(yao)性。因此(ci)(ci)，對于(yu)某(mou)些(xie)病(bing)毒(du)而言，同(tong)(tong)時給予多種(zhong)抗(kang)病(bing)毒(du)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(如抗(kang)HIV-1的(de)(de)(de)聯(lian)合藥(yao)(yao)(yao)物(wu)療法)可能(neng)(neng)會比使用(yong)(yong)(yong)單一的(de)(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)產生并(bing)維持更(geng)好的(de)(de)(de)抗(kang)病(bing)毒(du)作(zuo)用(yong)(yong)(yong)。但是不同(tong)(tong)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)相(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)(yong)比較(jiao)復雜，聯(lian)合用(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)后可能(neng)(neng)導致藥(yao)(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)(de)抗(kang)病(bing)毒(du)活(huo)(huo)性出現相(xiang)互拮抗(kang)、相(xiang)加或(huo)者(zhe)協同(tong)(tong)等(deng)作(zuo)用(yong)(yong)(yong)。因此(ci)(ci)，申請(qing)人(ren)應在(zai)體外試驗中(zhong)評(ping)價藥(yao)(yao)(yao)物(wu)與其他已上市(shi)的(de)(de)(de)、治(zhi)療相(xiang)同(tong)(tong)疾病(bing)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)之(zhi)間(jian)聯(lian)合用(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)的(de)(de)(de)抗(kang)病(bing)毒(du)活(huo)(huo)性。具體來(lai)說，應評(ping)價所(suo)研究藥(yao)(yao)(yao)物(wu)與所(suo)有已上市(shi)的(de)(de)(de)針(zhen)對相(xiang)同(tong)(tong)靶點的(de)(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)之(zhi)間(jian)聯(lian)合用(yong)(yong)(yong)藥(yao)(yao)(yao)的(de)(de)(de)抗(kang)病(bing)毒(du)活(huo)(huo)性，對于(yu)已上市(shi)的(de)(de)(de)治(zhi)療相(xiang)同(tong)(tong)適(shi)應癥的(de)(de)(de)不同(tong)(tong)靶點的(de)(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)，應選擇(ze)兩種(zhong)或(huo)兩種(zhong)以上進行此(ci)(ci)類研究。
建議申請人(ren)在開始(shi)評價聯合(he)用(yong)(yong)藥療效(xiao)的臨(lin)床試驗前(qian)，先完成(cheng)體(ti)(ti)外聯合(he)用(yong)(yong)藥的活性(xing)(xing)研究(jiu)。有時(shi)患者(zhe)會混(hun)合(he)感染(ran)兩種(zhong)或(huo)兩種(zhong)以上(shang)的病毒(如：HIV與HBV或(huo)HCV共(gong)感染(ran))，因此，體(ti)(ti)外聯合(he)用(yong)(yong)藥活性(xing)(xing)試驗還應(ying)考察治療同(tong)(tong)時(shi)感染(ran)不(bu)同(tong)(tong)種(zhong)類病毒的藥物(wu)與所研究(jiu)藥物(wu)合(he)用(yong)(yong)的體(ti)(ti)外抗病毒活性(xing)(xing)。
(五(wu))耐藥(yao)性
1.體外(wai)耐(nai)藥病毒株的選擇
本(ben)指(zhi)導(dao)原則主(zhu)要關注病(bing)毒(du)基因(yin)突變(bian)導(dao)致的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)對特定的(de)(de)(de)抗病(bing)毒(du)藥物的(de)(de)(de)表(biao)型(xing)(xing)敏感性(xing)降(jiang)低的(de)(de)(de)耐(nai)(nai)藥性(xing)。這里(li)所(suo)說的(de)(de)(de)耐(nai)(nai)藥性(xing)并(bing)不是(shi)絕對耐(nai)(nai)藥，而是(shi)一個相對的(de)(de)(de)概念。建議在開始(shi)以感染(ran)特定病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)患者為對象的(de)(de)(de)臨床(chuang)(chuang)試驗前，先通(tong)過(guo)(guo)體外(wai)試驗選(xuan)擇對藥物耐(nai)(nai)藥的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)株，鑒定耐(nai)(nai)藥株的(de)(de)(de)表(biao)型(xing)(xing)和基因(yin)型(xing)(xing)，并(bing)進行交叉(cha)耐(nai)(nai)藥性(xing)分析。盡管通(tong)過(guo)(guo)體外(wai)試驗獲得(de)的(de)(de)(de)耐(nai)(nai)藥性(xing)數據可(ke)能并(bing)不能準確預測臨床(chuang)(chuang)耐(nai)(nai)藥性(xing)，但仍建議申請人(ren)通(tong)過(guo)(guo)體外(wai)耐(nai)(nai)藥株選(xuan)擇試驗評價目標病(bing)毒(du)對藥物產生(sheng)耐(nai)(nai)藥性(xing)的(de)(de)(de)屏障，從(cong)而有助(zhu)于(yu)臨床(chuang)(chuang)試驗的(de)(de)(de)設計(ji)。
通過在(zai)(zai)細胞培(pei)養中(zhong)選(xuan)(xuan)擇(ze)對藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)病毒(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)，可(ke)以了解(jie)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)產生(sheng)(sheng)(sheng)遺(yi)傳閾值(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)高(gao)低(di)。遺(yi)傳閾值(zhi)低(di)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)可(ke)以選(xuan)(xuan)擇(ze)僅含1或2個(ge)突(tu)變(bian)(bian)位點的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)株(zhu)(zhu)(zhu)。而遺(yi)傳閾值(zhi)較高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)則(ze)可(ke)能(neng)在(zai)(zai)病毒(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)中(zhong)發(fa)生(sheng)(sheng)(sheng)多(duo)處突(tu)變(bian)(bian)才產生(sheng)(sheng)(sheng)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)。藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)和(he)目標病毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)許多(duo)因素(su)可(ke)對耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)產生(sheng)(sheng)(sheng)影響，如(ru)(ru)(ru)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)濃(nong)度。突(tu)變(bian)(bian)株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)出現速(su)率取(qu)決于病毒(du)(du)復(fu)制速(su)率、產生(sheng)(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)病毒(du)(du)基因組的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)量、復(fu)制機制的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)保真度以及宿(su)主因素(su)。對這些(xie)因素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)了解(jie)有助于設(she)計檢(jian)測耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)外試驗。例如(ru)(ru)(ru)，如(ru)(ru)(ru)果需要(yao)發(fa)生(sheng)(sheng)(sheng)多(duo)個(ge)突(tu)變(bian)(bian)方(fang)可(ke)對藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)產生(sheng)(sheng)(sheng)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)，則(ze)許多(duo)細胞培(pei)養系統(tong)提供的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)病毒(du)(du)滴(di)度可(ke)能(neng)不(bu)足以用(yong)(yong)于選(xuan)(xuan)擇(ze)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)病毒(du)(du)。遇到(dao)這種(zhong)情況(kuang)時(shi)，可(ke)以在(zai)(zai)逐漸(jian)增加藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)濃(nong)度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)條件下使病毒(du)(du)在(zai)(zai)細胞培(pei)養中(zhong)連(lian)續傳代(dai)，這樣可(ke)能(neng)會選(xuan)(xuan)擇(ze)出耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)株(zhu)(zhu)(zhu)。在(zai)(zai)評(ping)價耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)外試驗中(zhong)，藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)濃(nong)度范圍應(ying)覆蓋其在(zai)(zai)人體(ti)(ti)內的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)預期(qi)濃(nong)度。選(xuan)(xuan)擇(ze)對藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)突(tu)變(bian)(bian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)試驗應(ying)在(zai)(zai)下列條件下重復(fu)進行：使用(yong)(yong)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)野生(sheng)(sheng)(sheng)株(zhu)(zhu)(zhu)、使用(yong)(yong)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)株(zhu)(zhu)(zhu)、高(gao)選(xuan)(xuan)擇(ze)壓力及低(di)選(xuan)(xuan)擇(ze)壓力等(deng)，并確定(ding)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)試驗中(zhong)產生(sheng)(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)突(tu)變(bian)(bian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)類(lei)型是否相同(tong)，以評(ping)價藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)濃(nong)度與耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)遺(yi)傳屏障之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)關(guan)系。
當采用細(xi)胞培養系統復制目標病毒(du)時(shi)，可以(yi)采用下列(lie)兩種基本方法(fa)選擇對藥物敏感(gan)性降低的病毒(du)株：
l 病毒以(yi)較(jiao)高(gao)的MOI接種宿主細(xi)胞，在多種固定的藥物濃度下分別(bie)連續傳(chuan)代，誘(you)導(dao)耐(nai)藥株的產生。
l 病(bing)毒以較低的MOI接種宿主細胞，病(bing)毒傳代期間逐漸(jian)增加(jia)藥(yao)物濃(nong)度，起始藥(yao)物濃(nong)度接近藥(yao)物對親代病(bing)毒的EC50。
采用合適的(de)方法對(dui)病毒(du)的(de)復制(zhi)進行(xing)監測(ce)，通過對(dui)選擇(ze)期間(jian)分離株的(de)基(ji)因(yin)型(xing)和(he)表(biao)型(xing)的(de)鑒定，檢測(ce)耐藥毒(du)株的(de)產生。
HCV對藥(yao)物的耐(nai)藥(yao)性(xing)可以(yi)通過(guo)HCV復(fu)制子(zi)系統進行考察。使用HCV復(fu)制子(zi)細胞篩(shai)選HCV耐(nai)藥(yao)性(xing)的方法(fa)包括下列幾種：
l 在含(han)新霉素的(de)培(pei)養基(ji)中，多種(zhong)固定的(de)藥(yao)物濃度下，以較低的(de)密度培(pei)養HCV復(fu)制子細(xi)胞(bao)。含(han)有(you)耐藥(yao)性(xing)復(fu)制子的(de)細(xi)胞(bao)將會形成集落，應(ying)對其(qi)進行基(ji)因型和表型鑒定。
l 在不含新霉(mei)素的(de)(de)培(pei)養基(ji)中(zhong)，多種固定的(de)(de)藥物濃度(du)下，進行HCV復制子(zi)細胞傳(chuan)代。收集并保存每一代HCV復制子(zi)細胞，用于表型和基(ji)因型鑒定。
2.基因型分析(xi)
針(zhen)對(dui)體外(wai)試驗中篩選(xuan)出(chu)的(de)(de)耐藥(yao)株進行(xing)基(ji)(ji)因(yin)型(xing)(xing)分(fen)(fen)析，確定(ding)可能導致(zhi)病(bing)毒(du)對(dui)藥(yao)物(wu)(wu)敏(min)感性(xing)降(jiang)低的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)突(tu)(tu)變(bian)。針(zhen)對(dui)病(bing)毒(du)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)中的(de)(de)相關(guan)(guan)部(bu)分(fen)(fen)進行(xing)DNA序列(lie)分(fen)(fen)析，鑒(jian)定(ding)耐藥(yao)相關(guan)(guan)突(tu)(tu)變(bian)，這有利(li)于預測臨(lin)床療效，并且可以為闡述藥(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)作用機制(zhi)提供證據。應(ying)測定(ding)編碼目(mu)標蛋(dan)白的(de)(de)完整基(ji)(ji)因(yin)序列(lie)，對(dui)于導致(zhi)病(bing)毒(du)對(dui)所(suo)研究藥(yao)物(wu)(wu)耐藥(yao)的(de)(de)突(tu)(tu)變(bian)類(lei)型(xing)(xing)和導致(zhi)病(bing)毒(du)對(dui)其(qi)(qi)他同類(lei)藥(yao)物(wu)(wu)耐藥(yao)的(de)(de)突(tu)(tu)變(bian)類(lei)型(xing)(xing)進行(xing)比較(jiao)。對(dui)于較(jiao)大的(de)(de)病(bing)毒(du)(如皰疹(zhen)病(bing)毒(du)、痘病(bing)毒(du))，應(ying)對(dui)其(qi)(qi)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)中與所(suo)研究藥(yao)物(wu)(wu)作用靶點相關(guan)(guan)的(de)(de)部(bu)分(fen)(fen)進行(xing)測序，并分(fen)(fen)析其(qi)(qi)中所(suo)含的(de)(de)與耐藥(yao)性(xing)產生相關(guan)(guan)的(de)(de)突(tu)(tu)變(bian)。建(jian)議在幾(ji)種(zhong)遺傳背景(jing)(如毒(du)株、亞型(xing)(xing)、基(ji)(ji)因(yin)型(xing)(xing))中鑒(jian)定(ding)耐藥(yao)性(xing)產生的(de)(de)通路(lu);通過(guo)選(xuan)擇(ze)程(cheng)序獲(huo)得的(de)(de)毒(du)株如果同時出(chu)現(xian)了多種(zhong)突(tu)(tu)變(bian)，則應(ying)該鑒(jian)定(ding)各種(zhong)突(tu)(tu)變(bian)出(chu)現(xian)的(de)(de)先(xian)后順序。
進行基(ji)因型(xing)(xing)分(fen)析(xi)時(shi)，鼓勵申請人注明測(ce)序(xu)引物的(de)序(xu)列，并說(shuo)明這些引物可(ke)擴增出目標(biao)基(ji)因的(de)堿基(ji)數。還應說(shuo)明用于檢(jian)測(ce)少數病毒亞群的(de)基(ji)因型(xing)(xing)檢(jian)測(ce)方法的(de)靈(ling)敏度。闡明該(gai)突(tu)變在(zai)基(ji)因型(xing)(xing)分(fen)析(xi)中的(de)比例和(he)種類是十分(fen)重要的(de)。
3.表(biao)型分(fen)析
表(biao)型(xing)分(fen)析(xi)用(yong)于(yu)確(que)(que)定(ding)(ding)變(bian)異株(zhu)(zhu)對(dui)藥物的(de)(de)敏(min)(min)感性(xing)是(shi)否降(jiang)低。通(tong)過(guo)基(ji)因型(xing)分(fen)析(xi)鑒定(ding)(ding)出與(yu)耐藥性(xing)產(chan)生可(ke)能相關的(de)(de)突(tu)變(bian)后，如有(you)可(ke)能，則應在重組(zu)病毒(du)系統(即(ji)：使用(yong)定(ding)(ding)點突(tu)變(bian)技術，PCR擴增突(tu)變(bian)片段并(bing)導(dao)(dao)入實驗室(shi)標(biao)準株(zhu)(zhu)或使用(yong)其他適合的(de)(de)系統)中評價每一種突(tu)變(bian)導(dao)(dao)致表(biao)型(xing)耐藥的(de)(de)能力。通(tong)過(guo)體(ti)外試驗測定(ding)(ding)重組(zu)病毒(du)對(dui)藥物的(de)(de)敏(min)(min)感性(xing)，并(bing)確(que)(que)定(ding)(ding)EC50值。計算突(tu)變(bian)株(zhu)(zhu)與(yu)對(dui)照(zhao)株(zhu)(zhu)(生物學特性(xing)明確(que)(que)的(de)(de)野生型(xing)實驗室(shi)株(zhu)(zhu))的(de)(de)EC50值之比(EC50值增加的(de)(de)倍數)。
任何(he)標準的(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒學試驗方法都可用于計算(suan)(suan)病(bing)(bing)毒的(de)(de)(de)(de)表(biao)型(xing)耐(nai)(nai)藥(yao)的(de)(de)(de)(de)變化(如病(bing)(bing)毒相關(guan)蛋(dan)白檢測(ce)(ce)(ce)(ce)、PCR檢測(ce)(ce)(ce)(ce)病(bing)(bing)毒DNA或RNA、細胞(bao)病(bing)(bing)變檢測(ce)(ce)(ce)(ce)、MTT法檢測(ce)(ce)(ce)(ce)細胞(bao)毒性(xing)(xing)、報告基因表(biao)達檢測(ce)(ce)(ce)(ce)等)。通(tong)過測(ce)(ce)(ce)(ce)定突變株的(de)(de)(de)(de)EC50值(zhi)，并與在相同(tong)條件下(xia)同(tong)時(shi)測(ce)(ce)(ce)(ce)得(de)的(de)(de)(de)(de)對照株的(de)(de)(de)(de)EC50值(zhi)進(jin)行(xing)比(bi)較，計算(suan)(suan)突變株敏(min)感(gan)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)變化(耐(nai)(nai)藥(yao)性(xing)(xing)倍數的(de)(de)(de)(de)變化)。由于試驗中測(ce)(ce)(ce)(ce)得(de)的(de)(de)(de)(de)EC50值(zhi)比(bi)EC90或EC95值(zhi)更精確，應優先(xian)使用EC50值(zhi)。表(biao)型(xing)檢測(ce)(ce)(ce)(ce)方法的(de)(de)(de)(de)選(xuan)擇取決于其靈敏(min)度，即(ji)檢測(ce)(ce)(ce)(ce)耐(nai)(nai)藥(yao)株較對照株的(de)(de)(de)(de)敏(min)感(gan)性(xing)(xing)變化(耐(nai)(nai)藥(yao)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)倍數)的(de)(de)(de)(de)能力。計算(suan)(suan)耐(nai)(nai)藥(yao)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)倍數(耐(nai)(nai)藥(yao)株的(de)(de)(de)(de)EC50值(zhi)/參比(bi)株的(de)(de)(de)(de)EC50值(zhi))時(shi)，要求(qiu)表(biao)型(xing)檢測(ce)(ce)(ce)(ce)方法之間具(ju)有可比(bi)性(xing)(xing)。
4.交叉(cha)耐藥性
使用(yong)針對(dui)相(xiang)同(tong)(tong)(tong)靶(ba)(ba)點的(de)(de)抗病(bing)毒(du)(du)(du)藥(yao)(yao)物(wu)治療(liao)時，對(dui)某一(yi)種(zhong)藥(yao)(yao)物(wu)敏感(gan)(gan)(gan)性降低的(de)(de)變異，同(tong)(tong)(tong)時也可(ke)能(neng)會(hui)對(dui)相(xiang)同(tong)(tong)(tong)靶(ba)(ba)點的(de)(de)其他藥(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)敏感(gan)(gan)(gan)性降低或喪失，這種(zhong)現象稱(cheng)為交叉耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)。交叉耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)并不(bu)(bu)一(yi)定是可(ke)以類(lei)(lei)推(tui)的(de)(de)，因此評(ping)(ping)價所有(you)可(ke)能(neng)性非常重(zhong)要。例(li)如，如果(guo)病(bing)毒(du)(du)(du)X對(dui)A藥(yao)(yao)和B藥(yao)(yao)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)，而病(bing)毒(du)(du)(du)Y也對(dui)A藥(yao)(yao)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)，但(dan)病(bing)毒(du)(du)(du)Y可(ke)能(neng)仍(reng)對(dui)B藥(yao)(yao)敏感(gan)(gan)(gan)。建議通(tong)過表(biao)型(xing)(xing)(xing)分(fen)析(xi)評(ping)(ping)價所研究(jiu)(jiu)藥(yao)(yao)物(wu)對(dui)同(tong)(tong)(tong)類(lei)(lei)的(de)(de)已(yi)(yi)上(shang)市(shi)藥(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)毒(du)(du)(du)株(zhu)的(de)(de)有(you)效性，同(tong)(tong)(tong)時評(ping)(ping)價同(tong)(tong)(tong)類(lei)(lei)已(yi)(yi)上(shang)市(shi)藥(yao)(yao)物(wu)對(dui)所研究(jiu)(jiu)藥(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)毒(du)(du)(du)株(zhu)的(de)(de)有(you)效性。此外，如果(guo)藥(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)作用(yong)靶(ba)(ba)點相(xiang)同(tong)(tong)(tong)，但(dan)結(jie)構類(lei)(lei)型(xing)(xing)(xing)不(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)[例(li)如，核(he)苷類(lei)(lei)逆轉(zhuan)錄酶(mei)抑制劑(ji)(ji)(NRTIs)和非核(he)苷類(lei)(lei)逆轉(zhuan)錄酶(mei)抑制劑(ji)(ji)(NNRTIs)，其作用(yong)的(de)(de)靶(ba)(ba)點都是HIV的(de)(de)逆轉(zhuan)錄酶(mei)]，則建議對(dui)不(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)類(lei)(lei)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)進(jin)(jin)行交叉耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)性分(fen)析(xi)。建議檢(jian)測(ce)多(duo)種(zhong)耐(nai)(nai)藥(yao)(yao)株(zhu)和臨床分(fen)離病(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)對(dui)所研究(jiu)(jiu)藥(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)表(biao)型(xing)(xing)(xing)敏感(gan)(gan)(gan)性(范圍應(ying)能(neng)代表(biao)已(yi)(yi)知可(ke)導(dao)致病(bing)毒(du)(du)(du)對(dui)同(tong)(tong)(tong)類(lei)(lei)型(xing)(xing)(xing)藥(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)敏感(gan)(gan)(gan)性降低的(de)(de)不(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)突變和突變的(de)(de)組合)。如果(guo)表(biao)型(xing)(xing)(xing)檢(jian)測(ce)是在病(bing)毒(du)(du)(du)感(gan)(gan)(gan)染細(xi)胞系(xi)中進(jin)(jin)行的(de)(de)，則應(ying)該使用(yong)臨床分(fen)離病(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)對(dui)EC50值(zhi)進(jin)(jin)行校(xiao)驗。
四、針(zhen)對(dui)耐(nai)藥(yao)性產(chan)生的監測
應幫助醫生(sheng)及患者了解抗(kang)病毒(du)藥(yao)物的耐藥(yao)性(xing)信息，以(yi)協助其做出最佳的治(zhi)療決策(ce)。除此之(zhi)外，臨床試驗方(fang)案設(she)計和(he)藥(yao)物研發(fa)計劃通常與(yu)藥(yao)物的耐藥(yao)性(xing)和(he)交(jiao)叉耐藥(yao)性(xing)情況(kuang)密切相關。因此，強烈建議(yi)申請人根據藥(yao)物預期在(zai)臨床上應用的實際情況(kuang)，在(zai)藥(yao)物研發(fa)的各期臨床試驗中進行(xing)全面的耐藥(yao)性(xing)監(jian)測(ce)。
對于(yu)某些病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)，病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)載(zai)(zai)(zai)量(liang)的(de)(de)變(bian)化可作為判定抗病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)藥物臨(lin)床(chuang)療(liao)效(xiao)的(de)(de)終點指(zhi)標(biao)。在(zai)這種(zhong)情況下，可以(yi)用(yong)測(ce)(ce)(ce)定病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)載(zai)(zai)(zai)量(liang)的(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)進(jin)行耐藥性(xing)監測(ce)(ce)(ce)。基因(yin)型(xing)(xing)和(he)表(biao)型(xing)(xing)檢測(ce)(ce)(ce)是考察耐藥病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)是否出(chu)現(xian)的(de)(de)基礎，還有(you)可能(neng)表(biao)明病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)耐藥性(xing)與臨(lin)床(chuang)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)學失(shi)敗之間(jian)(jian)的(de)(de)關系(xi)。此外，表(biao)型(xing)(xing)和(he)基因(yin)型(xing)(xing)檢測(ce)(ce)(ce)結果還可用(yong)于(yu)指(zhi)導治療(liao)方(fang)法(fa)(fa)的(de)(de)選擇，或預測(ce)(ce)(ce)藥物在(zai)某一患者個(ge)體的(de)(de)療(liao)效(xiao)。對治療(liao)失(shi)敗或發生(sheng)了病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)反彈的(de)(de)患者中分(fen)(fen)離到的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)進(jin)行基因(yin)型(xing)(xing)檢測(ce)(ce)(ce)可以(yi)發現(xian)導致病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)對所研(yan)究(jiu)藥物敏(min)(min)感性(xing)降低(di)的(de)(de)基因(yin)突(tu)變(bian)。此外，進(jin)行基線基因(yin)型(xing)(xing)和(he)表(biao)型(xing)(xing)分(fen)(fen)析(xi)，可以(yi)根據基線病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)突(tu)變(bian)和(he)多態(tai)性(xing)及(ji)表(biao)型(xing)(xing)敏(min)(min)感性(xing)判斷治療(liao)結果。如果病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)載(zai)(zai)(zai)量(liang)未被作為主(zhu)要(yao)終點指(zhi)標(biao)，則(ze)建立檢測(ce)(ce)(ce)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)載(zai)(zai)(zai)量(liang)的(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)以(yi)及(ji)監測(ce)(ce)(ce)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)耐藥性(xing)的(de)(de)出(chu)現(xian)對于(yu)分(fen)(fen)析(xi)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)學指(zhi)標(biao)與臨(lin)床(chuang)結果之間(jian)(jian)的(de)(de)關系(xi)將(jiang)非常重要(yao)，而且有(you)助于(yu)完善擬(ni)進(jin)行的(de)(de)臨(lin)床(chuang)試驗的(de)(de)設(she)計(ji)。
建議申(shen)請人在開始以病(bing)毒(du)感染的患者為(wei)對象(xiang)的臨(lin)床(chuang)試驗(yan)前，首(shou)先制訂耐(nai)藥(yao)性監(jian)測(ce)(ce)計劃(hua)，并作為(wei)臨(lin)床(chuang)試驗(yan)方案的一部(bu)分。耐(nai)藥(yao)性監(jian)測(ce)(ce)計劃(hua)應至少包含下列內容：
l 描述檢測病毒載量(liang)的(de)試驗方法(fa)
l 病毒載量檢(jian)測方法(fa)及操作(zuo)特點
l 擬采用的基因型和(he)表型耐藥(yao)性檢測方(fang)法(fa)、步驟和(he)操作特(te)點(dian)
l 樣本采集和保存的方(fang)法(fa)
l 樣本的處理和運輸方法(冷凍或常溫)
l 擬進行的其他(ta)耐藥性分析(xi)
l 采集用于(yu)檢測(ce)病毒載量、基(ji)因型(xing)(xing)和表型(xing)(xing)以及其他耐藥性分析樣(yang)本的時間點(如基(ji)線、第24周(zhou)、第48周(zhou)、治療(liao)失敗(bai)或(huo)中止(zhi)試驗后(hou))
建議(yi)申請(qing)人在(zai)藥(yao)物(wu)(wu)研(yan)發(fa)的(de)(de)(de)(de)早期階(jie)段即制訂基(ji)(ji)因型(xing)和(he)(he)表型(xing)耐(nai)藥(yao)的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)線(xian)研(yan)究(jiu)以及有關耐(nai)藥(yao)性子課題的(de)(de)(de)(de)計劃(hua)。申請(qing)人應及時完成有關基(ji)(ji)線(xian)耐(nai)藥(yao)和(he)(he)治療(liao)(liao)(liao)后分(fen)(fen)離病(bing)毒株的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因型(xing)和(he)(he)表型(xing)分(fen)(fen)析，以便明(ming)確所研(yan)究(jiu)藥(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)耐(nai)藥(yao)性特征以及與其他藥(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)交叉耐(nai)藥(yao)情況。對(dui)于HBV和(he)(he)HCV等病(bing)毒，監測基(ji)(ji)線(xian)和(he)(he)治療(liao)(liao)(liao)后病(bing)毒的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因型(xing)耐(nai)藥(yao)對(dui)評估耐(nai)藥(yao)突(tu)變的(de)(de)(de)(de)發(fa)生至(zhi)關重要。通(tong)過比較分(fen)(fen)析治療(liao)(liao)(liao)失敗患(huan)者的(de)(de)(de)(de)樣(yang)本和(he)(he)基(ji)(ji)線(xian)樣(yang)本基(ji)(ji)因型(xing)，可以發(fa)現與耐(nai)藥(yao)性相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)突(tu)變。試(shi)驗方案(an)中(zhong)應明(ming)確說(shuo)明(ming)病(bing)毒學失敗和(he)(he)中(zhong)止研(yan)究(jiu)的(de)(de)(de)(de)定義。
對于以經治患者為對象的臨床試驗，強烈建議申(shen)請(qing)人收集(ji)(ji)全部患者研究(jiu)初始的基線分離(li)病毒株(zhu)的表型(xing)和基因型(xing)數(shu)據，同時(shi)收集(ji)(ji)所有病毒學失敗和退出研究(jiu)(病毒復制(zhi)未得到抑(yi)制(zhi))等終點時(shi)的表型(xing)和基因型(xing)數(shu)據。并注意應在患者仍在服用(yong)所研究(jiu)藥(yao)物時(shi)完(wan)成樣(yang)本采集(ji)(ji)。
在以(yi)(yi)初治患(huan)者為對象(xiang)的(de)(de)(de)臨床試驗中(zhong)，應(ying)設法獲得(de)來自于所(suo)有病(bing)毒(du)(du)(du)學失敗(bai)和(he)中(zhong)止研究(病(bing)毒(du)(du)(du)復制尚未得(de)到抑制)的(de)(de)(de)患(huan)者的(de)(de)(de)基(ji)線(xian)分(fen)離(li)(li)病(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)和(he)終點分(fen)離(li)(li)病(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)的(de)(de)(de)表(biao)型和(he)基(ji)因型數據。在以(yi)(yi)未接受過治療的(de)(de)(de)患(huan)者為對象(xiang)的(de)(de)(de)研究中(zhong)，應(ying)收集(ji)并保存所(suo)有患(huan)者的(de)(de)(de)基(ji)線(xian)時(shi)的(de)(de)(de)生物樣本，以(yi)(yi)備在病(bing)毒(du)(du)(du)學失敗(bai)時(shi)進(jin)行表(biao)型和(he)基(ji)因型分(fen)析。
根據(ju)(ju)臨床試(shi)驗方(fang)案(an)或(huo)研究人群(qun)的(de)具(ju)體情況，有(you)時(shi)(shi)可能(neng)需要(yao)進(jin)行額外(wai)的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)型和表型評價或(huo)亞組分析，因(yin)此在(zai)(zai)臨床試(shi)驗的(de)各(ge)個(ge)階(jie)段(基(ji)(ji)(ji)線(xian)(xian)及治療(liao)階(jie)段)采集并(bing)保存(cun)樣(yang)本(ben)是非(fei)常(chang)必要(yao)的(de)。申(shen)請人有(you)時(shi)(shi)會提出當體外(wai)數據(ju)(ju)提示病毒在(zai)(zai)單一突變后(hou)導致高度表型耐藥時(shi)(shi)，在(zai)(zai)基(ji)(ji)(ji)線(xian)(xian)和病毒學失敗時(shi)(shi)收集初治患者亞組的(de)樣(yang)本(ben)。對(dui)這樣(yang)的(de)研究方(fang)案(an)事先應進(jin)行討論。
申(shen)(shen)請(qing)(qing)人(ren)(ren)(ren)可(ke)(ke)(ke)以選擇自己(ji)進行(xing)(xing)病毒(du)(du)載量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)和(he)表(biao)型(xing)及(ji)基因型(xing)耐藥(yao)(yao)性(xing)(xing)分(fen)析(xi)，也可(ke)(ke)(ke)以將(jiang)生(sheng)物(wu)樣本委托給(gei)其他有(you)資質的(de)(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)室(shi)進行(xing)(xing)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)。實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)室(shi)樣品(pin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)處理應(ying)按(an)照合適的(de)(de)(de)(de)(de)(de)操作程序進行(xing)(xing)。如(ru)果(guo)某(mou)項試(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)未(wei)按(an)照生(sheng)產廠家的(de)(de)(de)(de)(de)(de)技術規范操作，則該試(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結果(guo)可(ke)(ke)(ke)能不會被接(jie)受。鼓勵申(shen)(shen)請(qing)(qing)人(ren)(ren)(ren)使(shi)用(yong)(yong)經過鑒定(ding)和(he)驗(yan)(yan)(yan)證(zheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)方(fang)法(fa)。如(ru)果(guo)使(shi)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)屬于(yu)研究性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，則建議申(shen)(shen)請(qing)(qing)人(ren)(ren)(ren)提供該檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)操作特性(xing)(xing)參(can)數(如(ru)準(zhun)確性(xing)(xing)、精密度、檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)限(xian)及(ji)定(ding)量限(xian)、特異性(xing)(xing)、線性(xing)(xing)、檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)范圍、耐受性(xing)(xing)、穩(wen)定(ding)性(xing)(xing))，同時應(ying)描述(shu)病毒(du)(du)來源(yuan)(如(ru)血(xue)液、血(xue)漿)、保存條(tiao)件及(ji)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)、細胞(bao)培(pei)養程序。與用(yong)(yong)于(yu)鑒定(ding)藥(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗病毒(du)(du)活性(xing)(xing)及(ji)耐藥(yao)(yao)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)探(tan)索性(xing)(xing)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)相(xiang)比(bi)，臨床實(shi)(shi)踐中使(shi)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)需要經過更加(jia)全面的(de)(de)(de)(de)(de)(de)驗(yan)(yan)(yan)證(zheng)。研究者(zhe)使(shi)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)常(chang)規商業檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)應(ying)該經過鑒定(ding)，但可(ke)(ke)(ke)能不需要提供方(fang)法(fa)學參(can)數。申(shen)(shen)請(qing)(qing)人(ren)(ren)(ren)應(ying)就某(mou)一(yi)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)需要校(xiao)驗(yan)(yan)(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)次(ci)數和(he)性(xing)(xing)質以及(ji)相(xiang)關(guan)(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)學參(can)數[如(ru)數據主控文檔(DMF)]與審評人(ren)(ren)(ren)員進行(xing)(xing)討論。建議申(shen)(shen)請(qing)(qing)人(ren)(ren)(ren)在(zai)III期(qi)臨床試(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中進行(xing)(xing)特定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)析(xi)或測(ce)(ce)(ce)量時使(shi)用(yong)(yong)一(yi)致的(de)(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)，對(dui)特定(ding)患者(zhe)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)析(xi)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)應(ying)在(zai)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)期(qi)間保持不變。如(ru)果(guo)在(zai)藥(yao)(yao)物(wu)研發期(qi)間使(shi)用(yong)(yong)了任(ren)何新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)，應(ying)提供支持這(zhe)種新(xin)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)關(guan)(guan)數據。
五、病(bing)毒學研究(jiu)報(bao)告(gao)
完整的(de)病(bing)毒學(xue)研(yan)究報告(gao)內容比較廣泛，應包含原(yuan)始數(shu)據(ju)(ju)和(he)相關衍生(sheng)數(shu)據(ju)(ju)、獲(huo)得數(shu)據(ju)(ju)的(de)程序和(he)評價數(shu)據(ju)(ju)所需的(de)信(xin)息(xi)。病(bing)毒學(xue)研(yan)究報告(gao)中應包含藥物(wu)的(de)非臨(lin)床(chuang)研(yan)究及臨(lin)床(chuang)抗病(bing)毒活(huo)性信(xin)息(xi)、接受過治(zhi)療的(de)患者的(de)耐藥信(xin)息(xi)、與同類(lei)藥物(wu)的(de)交叉耐藥的(de)信(xin)息(xi)、基(ji)線基(ji)因型和(he)表型病(bing)毒學(xue)應答分析。
病毒學研(yan)究報告的(de)格式通常應包含下列部(bu)(bu)分： 概要、引(yin)言、材(cai)料與方(fang)法(fa)、結(jie)果及討(tao)論(lun)。在方(fang)法(fa)部(bu)(bu)分應描(miao)述使(shi)用的(de)全部(bu)(bu)試驗方(fang)法(fa)，同(tong)時應對(dui)使(shi)用的(de)統計分析方(fang)法(fa)進行描(miao)述。
六、總結
本指導原則(ze)介紹了抗(kang)病毒藥(yao)物(wu)(wu)研(yan)(yan)發和申請審評相(xiang)關的病毒學研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)項目，目的在于(yu)使對抗(kang)病毒藥(yao)物(wu)(wu)的分析(xi)更加全面。這(zhe)種分析(xi)有(you)助(zhu)于(yu)提供支持(chi)藥(yao)物(wu)(wu)應用于(yu)人(ren)體的數據(ju)，同時還有(you)助(zhu)于(yu)確定量(liang)效關系、設計(ji)臨床試驗(yan)、選(xuan)擇合(he)適的患者人(ren)群。因此，這(zhe)些(xie)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)數據(ju)會對藥(yao)物(wu)(wu)的治療成功率產生影響。
體(ti)外非(fei)臨床病(bing)(bing)毒(du)(du)學研究(jiu)能為體(ti)內(nei)試(shi)驗的(de)(de)(de)設計提供有(you)用的(de)(de)(de)信息，而(er)且有(you)助于預測(ce)體(ti)內(nei)試(shi)驗中耐(nai)藥(yao)(yao)株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)產生(sheng)，所以(yi)(yi)在開(kai)始I期臨床試(shi)驗前須先進行非(fei)臨床研究(jiu)。開(kai)展以(yi)(yi)感染某種(zhong)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)患者為研究(jiu)對象的(de)(de)(de)臨床試(shi)驗前，應詳(xiang)細分析體(ti)外試(shi)驗中選擇到的(de)(de)(de)耐(nai)藥(yao)(yao)病(bing)(bing)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)。本指(zhi)導(dao)原則還(huan)就如何(he)及(ji)何(he)時進行病(bing)(bing)毒(du)(du)學研究(jiu)提出了建(jian)議。這些信息可以(yi)(yi)寫(xie)入(ru)產品(pin)說(shuo)明書中，以(yi)(yi)便臨床醫生(sheng)正確(que)開(kai)具(ju)抗病(bing)(bing)毒(du)(du)藥(yao)(yao)物處方(fang)，同時使治(zhi)療(liao)成功率達到最(zui)大。
由于臨(lin)床(chuang)治療的(de)(de)需求，抗(kang)病毒(du)(du)藥(yao)的(de)(de)研(yan)發已成為(wei)新藥(yao)開發的(de)(de)關(guan)(guan)注(zhu)(zhu)點。同時(shi)，病毒(du)(du)學研(yan)究的(de)(de)經驗逐漸積(ji)累，研(yan)究水(shui)平亦在不斷提高。建議申請人在開展(zhan)抗(kang)病毒(du)(du)藥(yao)物的(de)(de)病毒(du)(du)學研(yan)究時(shi)關(guan)(guan)注(zhu)(zhu)本指(zhi)導(dao)原則中提及的(de)(de)要素(su)，同時(shi)鼓勵申請人就新藥(yao)臨(lin)床(chuang)前和臨(lin)床(chuang)病毒(du)(du)學研(yan)究的(de)(de)相關(guan)(guan)問題(ti)與審(shen)評機構(gou)進行討論和溝通。
參考(kao)文(wen)獻
FDA. Guidance for industry: Antiviral Product Development — Conducting and Submitting Virology Studies to the Agency. 2006.6
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