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核酸擴增法檢測試劑主要原材料、生產工藝及質量控制注冊技術審查指導原則（報批稿）

一、前言

本指導原則(ze)的(de)主(zhu)要目的(de)是規范申請人(ren)對(dui)核酸(suan)擴增法檢(jian)測試劑的(de)主(zhu)要原材料研(yan)究資料、生產工藝及反應體系研(yan)究資料的(de)準備，并對(dui)產品質量控(kong)制提出指導性技術要求(qiu)。

本指導原(yuan)則系對(dui)核酸擴(kuo)增法(fa)檢測試劑的一般要(yao)求，申請人應依據產品特性(xing)確定其中(zhong)的具體內容是否適用(yong)(yong)，若(ruo)不(bu)適用(yong)(yong)，需(xu)詳細闡述其理由及(ji)相應的科學依據。

本(ben)指導(dao)原則(ze)是(shi)對申請人和審(shen)查人員的指導(dao)性文件，但不包括注(zhu)冊(ce)審(shen)批所涉(she)及的行政(zheng)事項，亦(yi)不作為法(fa)(fa)規強制執(zhi)行，如果有能(neng)夠滿足相關法(fa)(fa)規要求的其它(ta)方(fang)法(fa)(fa)，也可以采用，但是(shi)需要提供詳細(xi)的研(yan)究資料和驗證資料。應在遵循相關法(fa)(fa)規的前提下(xia)使(shi)用本(ben)指導(dao)原則(ze)。

本(ben)(ben)指導(dao)原(yuan)則是(shi)在現行法(fa)規(gui)和標準體系以及當(dang)前認(ren)知水平下制(zhi)訂(ding)的(de)，隨(sui)著法(fa)規(gui)和標準的(de)不斷(duan)(duan)完善(shan)，以及科學技術的(de)不斷(duan)(duan)發展，本(ben)(ben)指導(dao)原(yuan)則相關內容(rong)也(ye)將(jiang)進行適(shi)時的(de)調(diao)整(zheng)。

二、適用范圍

本指導原(yuan)則適用于核(he)酸(suan)擴增法檢測(ce)試劑的注冊技術審查，其他類核(he)酸(suan)檢測(ce)試劑可(ke)參照相(xiang)關內容(rong)。

三、基本要求

（一）基本原則

1.核酸擴增類(lei)檢測試劑的(de)(de)生(sheng)產企業應(ying)獲得《醫(yi)療器械生(sheng)產許(xu)可證》。研(yan)制、生(sheng)產用的(de)(de)各種原料、輔料等(deng)應(ying)制定其相應(ying)的(de)(de)質量(liang)標準(zhun)，并應(ying)符(fu)合有(you)關法規的(de)(de)要(yao)求(qiu)。

2．試劑生(sheng)產(chan)(chan)企業應(ying)具有與其技術要求相適應(ying)的(de)人(ren)員(yuan)、廠房、設(she)施和(he)儀器(qi)設(she)備(bei)以(yi)(yi)及(ji)適宜的(de)生(sheng)產(chan)(chan)環境，配(pei)備(bei)滿足核酸(suan)提取和(he)擴增檢測以(yi)(yi)及(ji)操作人(ren)員(yuan)防(fang)護所需(xu)的(de)設(she)備(bei)。建立(li)專用實驗(yan)室(shi)(shi)，實驗(yan)室(shi)(shi)應(ying)當嚴格分區，人(ren)員(yuan)和(he)物(wu)品應(ying)當單向流動，以(yi)(yi)最大(da)限度地(di)防(fang)止實驗(yan)過程中樣品之間的(de)污(wu)染和(he)避(bi)免(mian)擴增產(chan)(chan)物(wu)的(de)污(wu)染。生(sheng)產(chan)(chan)用于病原微生(sheng)物(wu)核酸(suan)檢測的(de)生(sheng)產(chan)(chan)企業應(ying)建立(li)符合生(sheng)物(wu)安全要求的(de)設(she)施和(he)措施。

3.試劑生(sheng)產(chan)企業應(ying)按照《體外診(zhen)斷(duan)試劑生(sheng)產(chan)實施細(xi)則（試行）》的(de)要求，建立(li)相應(ying)的(de)質(zhi)量管理體系，并應(ying)通過《體外診(zhen)斷(duan)試劑生(sheng)產(chan)企業質(zhi)量管理體系考(kao)核(he)(he)評(ping)定標準（試行）》的(de)考(kao)核(he)(he)。

4.核酸擴(kuo)(kuo)增(zeng)類檢(jian)測(ce)試(shi)(shi)劑的引物(wu)設(she)計應當符(fu)合核酸檢(jian)測(ce)設(she)計的要求，擴(kuo)(kuo)增(zeng)體(ti)系(xi)應設(she)定合理(li)的內標(biao)(biao)和外(wai)標(biao)(biao)，試(shi)(shi)劑需設(she)置抗污(wu)染的特定措(cuo)施，擴(kuo)(kuo)增(zeng)產物(wu)須進行(xing)確證研究。

5.企業使用(yong)新型(xing)原材(cai)(cai)料時，應提供與通行原材(cai)(cai)料比對研究(jiu)結果及相關資料。使用(yong)未(wei)列入上述標準的化學試劑，應不低于分析純。

（二）原材料

應提供(gong)主(zhu)(zhu)要原(yuan)材(cai)(cai)料如(ru)引物、探針、企業參考品(pin)或(huo)標準(zhun)品(pin)等(deng)的(de)(de)選擇與來(lai)源、制備過程、質(zhi)量分析(xi)和(he)質(zhi)量標準(zhun)等(deng)的(de)(de)相(xiang)關研究資料。若主(zhu)(zhu)要原(yuan)材(cai)(cai)料為(wei)企業自(zi)己生產(chan)，其生產(chan)工藝(yi)(yi)必須相(xiang)對(dui)穩(wen)定；如(ru)主(zhu)(zhu)要原(yuan)材(cai)(cai)料來(lai)自(zi)市場（從其他單位(wei)購買），應提供(gong)的(de)(de)資料包括(kuo)：對(dui)物料供(gong)應商審核的(de)(de)相(xiang)關資料、購買合同、供(gong)貨方(fang)提供(gong)的(de)(de)質(zhi)量標準(zhun)、出廠檢定報告，以及(ji)該原(yuan)材(cai)(cai)料到貨后的(de)(de)質(zhi)量檢驗資料。主(zhu)(zhu)要原(yuan)材(cai)(cai)料（包括(kuo)生產(chan)工藝(yi)(yi)）或(huo)其供(gong)應商發生變更，應依(yi)據國家相(xiang)關法(fa)規的(de)(de)要求進行變更申請。

核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無DNase和RNase污染。

1.脫氧(yang)三(san)磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包(bao)括(kuo)：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應為(wei)HPLC純、PCR級(ji)，無DNase和RNase污染(ran)。—20℃保存。

2.引物

由一(yi)定數量的dNTP構成(cheng)的特定序列，通常(chang)采用DNA合成(cheng)儀(yi)人工(gong)合成(cheng)，合成(cheng)后經聚丙烯酰(xian)胺凝膠(jiao)電(dian)泳(yong)或其(qi)他適宜方法純化。

凍干(gan)粉，序列正確，合(he)成量應(ying)達到(dao)試劑(ji)生產(chan)要求。純度應(ying)達到(dao)電(dian)泳(yong)級（PAGE）或(huo)HPLC級，不含雜帶。應(ying)提供合(he)成機構出(chu)具的(de)合(he)成產(chan)物(wu)的(de)質檢證明，如PAGE電(dian)泳(yong)結果或(huo)HPLC分析圖譜。

應(ying)作(zuo)HPLC分析和紫(zi)外(wai)光吸收分析。以紫(zi)外(wai)分光光度計測定OD260nm/OD280nm的(de)比值在1.6—2.0之間，可視為(wei)合(he)格引物(wu)。—20℃保存。

3.探針

是(shi)指(zhi)特定的(de)帶有示(shi)蹤物(wu)（標(biao)記(ji)(ji)(ji)物(wu)）的(de)已知核(he)酸(suan)片(pian)段（寡(gua)聚(ju)核(he)苷(gan)酸(suan)片(pian)段），能與互補核(he)酸(suan)序列(lie)退火雜(za)交，用于特定核(he)酸(suan)序列(lie)的(de)探(tan)測(ce)。通常采用DNA合(he)成(cheng)儀人工合(he)成(cheng)，合(he)成(cheng)后經聚(ju)丙烯(xi)酰胺凝膠電(dian)泳或(huo)其他(ta)適(shi)宜方法純(chun)化，在(zai)5'-端(和(he)/或(huo)3'-端)進行標(biao)記(ji)(ji)(ji)，如熒(ying)光(guang)素報告基團(tuan)或(huo)其他(ta)發光(guang)標(biao)記(ji)(ji)(ji)物(wu)，在(zai)3'-端標(biao)記(ji)(ji)(ji)熒(ying)光(guang)素淬滅基團(tuan)，并經HPLC或(huo)其他(ta)適(shi)宜方法純(chun)化。

凍干粉，純度應(ying)達到HPLC純。應(ying)提供合成機構(gou)出具的(de)(de)合成產物(wu)的(de)(de)質檢證明，如HPLC分(fen)析圖譜；應(ying)對探針的(de)(de)核(he)酸序列及標(biao)(biao)記的(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)(su)或化學發光(guang)(guang)(guang)物(wu)進(jin)行核(he)實，并(bing)作HPLC分(fen)析。應(ying)以可見—紫外分(fen)光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)度計進(jin)行200—800nm掃描，在(zai)(zai)(zai)260nm處(chu)應(ying)有(you)(you)吸收(shou)峰。另外，根據標(biao)(biao)記熒(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)(su)的(de)(de)不同，還應(ying)該在(zai)(zai)(zai)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)(su)的(de)(de)激(ji)發波長處(chu)有(you)(you)吸收(shou)峰，如FAM熒(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)(su)在(zai)(zai)(zai)494nm、TET熒(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)(su)在(zai)(zai)(zai)521nm、TAMRA熒(ying)光(guang)(guang)(guang)素(su)(su)在(zai)(zai)(zai)560nm處(chu)有(you)(you)特(te)異(yi)(yi)的(de)(de)吸收(shou)峰，雜交探針在(zai)(zai)(zai)493nm、625nm、685nm處(chu)有(you)(you)特(te)異(yi)(yi)的(de)(de)吸收(shou)峰，檢定(ding)合格后(hou)入庫。避光(guang)(guang)(guang)、—20℃保(bao)存。

4.DNA聚合酶

如Taq DNA聚(ju)合酶(mei)。應具有DNA聚(ju)合酶(mei)活(huo)性(xing)(xing)，無核酸(suan)內切(qie)酶(mei)活(huo)性(xing)(xing)；具熱(re)穩定性(xing)(xing)，94℃保(bao)溫1小時(shi)后仍保(bao)持50%活(huo)性(xing)(xing)。—20℃保(bao)存。

5.尿(niao)嘧啶(ding)糖基(ji)化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性，IU UNG在 37℃處理3分鐘后，10³拷貝以下含(han)U模板應完全降解，不能產(chan)生擴增產(chan)物。—20℃保存(cun)。

6.逆轉錄酶

具逆轉(zhuan)錄酶活性，無核酸(suan)內切酶活性。—20℃保存。

（三）生產工藝

核酸擴增類檢(jian)測試(shi)劑的基本生產工藝通(tong)常包(bao)括(kuo)：配(pei)制(zhi)(zhi)工作液、半成(cheng)品檢(jian)定(ding)、分裝和包(bao)裝。配(pei)制(zhi)(zhi)工作液的各種(zhong)原(yuan)材料及其配(pei)比應符合要求，原(yuan)材料應混合均勻，配(pei)制(zhi)(zhi)過程(cheng)應對pH、電導率(lv)等(deng)關鍵參數進(jin)行(xing)有效控制(zhi)(zhi)。

工藝(yi)研究(jiu)的資料應(ying)能(neng)對反應(ying)體系涉及到的基本(ben)內(nei)容，如樣本(ben)類型(xing)、樣本(ben)用(yong)量(liang)、試劑(ji)用(yong)量(liang)、反應(ying)條件、校準(zhun)方法、質控方法、臨界值的確定、穩定性和有效期，提供(gong)確切(qie)的依據。

（四）質量控制

1.半成品質量控制

（1）按批號抽取(qu)規定數量的(de)半成品。

（2）以參考(kao)(kao)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)/對照品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)進(jin)行半成品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)質量控(kong)(kong)(kong)制(zhi)。如果(guo)產品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)具有(you)國(guo)家標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)或參考(kao)(kao)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)，應(ying)以其進(jin)行檢定。如果(guo)產品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)不具有(you)國(guo)家標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)或參考(kao)(kao)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)，應(ying)根據規定制(zhi)備相應(ying)的(de)(de)(de)企業參考(kao)(kao)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)，企業參考(kao)(kao)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)的(de)(de)(de)制(zhi)備應(ying)有(you)規范的(de)(de)(de)質量控(kong)(kong)(kong)制(zhi)程序(xu)，以保證產品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)的(de)(de)(de)安(an)全性(xing)、有(you)效(xiao)性(xing)及(ji)質量可控(kong)(kong)(kong)，其質量應(ying)不低于國(guo)家食(shi)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)藥(yao)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)監督管理局已經批準(zhun)的(de)(de)(de)同類產品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)的(de)(de)(de)質量。

（3）半成品(pin)檢定(ding)內容包括：陰(yin)/陽性(xing)參考品(pin)符合(he)率、靈敏度(du)、特異性(xing)、精密度(du)。檢測結果應符合(he)質量標準的(de)要求。

（4）半成(cheng)品檢定(ding)合格后，按試劑盒組成(cheng)及時進行(xing)分裝和包裝。

2.成品質量控制

（1）每一(yi)批核酸擴(kuo)增類檢測(ce)試劑(ji)報批批量應不低于3000人份。

（2）產品(pin)完成包(bao)裝后，應根據生產量進行(xing)抽樣和(he)生產記錄審核。

（3）以參考品(pin)/對照品(pin)進行成品(pin)質量檢驗。結(jie)果應符合要求。

（4）成品檢驗的內容(rong)應包括：陰(yin)/陽性(xing)參考品符合率、靈敏度(du)、特(te)異性(xing)、精密度(du)、線(xian)性(xing)范圍（定(ding)量產品）和穩定(ding)性(xing)。

5．試(shi)(shi)劑批放行(xing)前(qian)，應對(dui)需要進行(xing)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)考核的(de)試(shi)(shi)劑成(cheng)分(fen)，在(zai)特定(ding)(ding)(ding)溫度或條件下進行(xing)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)。穩(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)可采用加(jia)速破壞試(shi)(shi)驗(yan)(yan)。

四、名詞解釋

核酸擴增法檢測試劑：核(he)酸擴(kuo)增(zeng)(zeng)技術泛指以(yi)擴(kuo)增(zeng)(zeng)DNA或(huo)(huo)RNA為手段，檢(jian)測(ce)(ce)特定核(he)酸序列或(huo)(huo)篩查特定基因的檢(jian)測(ce)(ce)技術，如聚(ju)合酶(mei)鏈(lian)反應(ying)(ying)（PCR）、連接(jie)酶(mei)鏈(lian)反應(ying)(ying)（LCR）、轉錄依賴的擴(kuo)增(zeng)(zeng)反應(ying)(ying)（TMA）等(deng)。核(he)酸擴(kuo)增(zeng)(zeng)法檢(jian)測(ce)(ce)試劑(ji)是基于(yu)核(he)酸擴(kuo)增(zeng)(zeng)檢(jian)測(ce)(ce)技術的體(ti)外(wai)診斷試劑(ji)，目(mu)前已經用于(yu)病原體(ti)檢(jian)測(ce)(ce)、特定疾(ji)病的早期診斷和體(ti)內物質的型別(bie)鑒定等(deng)不同領域。

五、參考文獻

1.《中(zhong)國生物制(zhi)品規程》（2000年版(ban)），化學(xue)工業出(chu)版(ban)社(she)