内射女校花一区二区三区,亚洲AV永久无码精品九之

我們的服務

酶聯免疫吸附實驗（ELISA）基本原理

基(ji)本原理(li)

　　1971年Engvall和Perlmann發表(biao)(biao)了酶(mei)(mei)聯免(mian)疫吸附劑測定(ding)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用(yong)(yong)(yong)于(yu)IgG定(ding)量(liang)(liang)(liang)測定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)文(wen)章，使(shi)得1966年開始用(yong)(yong)(yong)于(yu)抗(kang)(kang)原(yuan)定(ding)位的(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei)(mei)標(biao)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)技術發展成液體(ti)(ti)(ti)(ti)標(biao)本(ben)(ben)中(zhong)(zhong)微量(liang)(liang)(liang)物(wu)(wu)質的(de)(de)(de)(de)(de)測定(ding)方(fang)法(fa)。這(zhe)一(yi)(yi)方(fang)法(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)基本(ben)(ben)原(yuan)理是：①使(shi)抗(kang)(kang)原(yuan)或(huo)(huo)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)結(jie)合到某種(zhong)固相(xiang)載體(ti)(ti)(ti)(ti)表(biao)(biao)面，并保持其免(mian)疫活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)。②使(shi)抗(kang)(kang)原(yuan)或(huo)(huo)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)與(yu)某種(zhong)酶(mei)(mei)連接成酶(mei)(mei)標(biao)抗(kang)(kang)原(yuan)或(huo)(huo)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)，這(zhe)種(zhong)酶(mei)(mei)標(biao)抗(kang)(kang)原(yuan)或(huo)(huo)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)既保留(liu)其免(mian)疫活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)，又保留(liu)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)。在(zai)測定(ding)時，把(ba)受(shou)(shou)檢標(biao)本(ben)(ben)（測定(ding)其中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)或(huo)(huo)抗(kang)(kang)原(yuan)）和酶(mei)(mei)標(biao)抗(kang)(kang)原(yuan)或(huo)(huo)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)按不同的(de)(de)(de)(de)(de)步驟與(yu)固相(xiang)載體(ti)(ti)(ti)(ti)表(biao)(biao)面的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)原(yuan)或(huo)(huo)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)起反(fan)應(ying)(ying)。用(yong)(yong)(yong)洗滌的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)使(shi)固相(xiang)載體(ti)(ti)(ti)(ti)上(shang)形成的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)原(yuan)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)復合物(wu)(wu)與(yu)其他物(wu)(wu)質分(fen)開，最(zui)后結(jie)合在(zai)固相(xiang)載體(ti)(ti)(ti)(ti)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei)(mei)量(liang)(liang)(liang)與(yu)標(biao)本(ben)(ben)中(zhong)(zhong)受(shou)(shou)檢物(wu)(wu)質的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)成一(yi)(yi)定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)比例。加(jia)入酶(mei)(mei)反(fan)應(ying)(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)底物(wu)(wu)后，底物(wu)(wu)被酶(mei)(mei)催化變為有色產(chan)物(wu)(wu)，產(chan)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)與(yu)標(biao)本(ben)(ben)中(zhong)(zhong)受(shou)(shou)檢物(wu)(wu)質的(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)直接相(xiang)關(guan)，故可(ke)(ke)根(gen)據顏色反(fan)應(ying)(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)深淺刊(kan)物(wu)(wu)定(ding)性(xing)(xing)(xing)或(huo)(huo)定(ding)量(liang)(liang)(liang)分(fen)析。由于(yu)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)催化頻率很(hen)高(gao)，故可(ke)(ke)極大(da)地(di)(di)地(di)(di)放大(da)反(fan)應(ying)(ying)效(xiao)果，從而使(shi)測定(ding)方(fang)法(fa)達(da)到很(hen)高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)敏感度。　

主要方法類型和操作步(bu)驟(zou)

　　ELISA可(ke)用于測(ce)(ce)定抗(kang)(kang)(kang)原，也(ye)可(ke)用于測(ce)(ce)定抗(kang)(kang)(kang)體(ti)。在這種(zhong)測(ce)(ce)定方法中有(you)3種(zhong)必要的(de)(de)試劑：①固相(xiang)的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)原或抗(kang)(kang)(kang)體(ti)，②酶標記的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)原或抗(kang)(kang)(kang)體(ti)，③酶作用的(de)(de)底(di)物。根據試劑的(de)(de)來源和標本的(de)(de)性狀以及檢(jian)測(ce)(ce)的(de)(de)具備條件，可(ke)設計(ji)出各種(zhong)不同類型的(de)(de)檢(jian)測(ce)(ce)方法。　

　（一）雙(shuang)抗體夾心法

　　雙抗體(ti)夾心法(fa)是檢測抗原(yuan)最常用(yong)的方法(fa)，操(cao)作步驟如下：

　　（a）將特異性(xing)抗體(ti)與固(gu)相(xiang)載體(ti)連接，形成固(gu)相(xiang)抗體(ti)：洗(xi)滌除(chu)去未結合的抗體(ti)及雜質。

　　（b）加受檢標本(ben)：使(shi)之與(yu)固相抗(kang)(kang)體(ti)接觸反應一段時(shi)間，讓標本(ben)中的(de)抗(kang)(kang)原與(yu)固相載(zai)體(ti)上的(de)抗(kang)(kang)體(ti)結合，形成固相抗(kang)(kang)原復合物。洗滌除去其他未結合的(de)物質。

　　（c）加酶(mei)標抗體：使(shi)固相免(mian)疫(yi)復合物上(shang)的抗原與(yu)酶(mei)標抗體結(jie)合。徹底洗滌(di)未結(jie)合的酶(mei)標抗體。此時固相載(zai)體上(shang)帶(dai)有的酶(mei)量與(yu)標本中受檢(jian)物質(zhi)的量正(zheng)相關。

　　（4）加底物(wu)(wu)：夾(jia)心式(shi)復合物(wu)(wu)中的酶催化(hua)底物(wu)(wu)成(cheng)為有色(se)產物(wu)(wu)。根(gen)據顏(yan)色(se)反應的程度進行該抗原的定性或定量。

　　根據同樣原(yuan)理，將大分子抗(kang)原(yuan)分別制備固相抗(kang)原(yuan)和酶標抗(kang)原(yuan)結合物(wu)，即可用雙抗(kang)原(yuan)夾心法測(ce)定標本中的(de)抗(kang)體(ti)。

　　（二）一步法

　　在(zai)雙抗(kang)體夾(jia)心法測定(ding)抗(kang)原(yuan)(yuan)時(shi)(shi)，如應(ying)(ying)用(yong)針對抗(kang)原(yuan)(yuan)分子上(shang)兩個不(bu)同抗(kang)原(yuan)(yuan)決(jue)定(ding)簇(cu)的(de)(de)單(dan)(dan)克(ke)隆抗(kang)體分別作(zuo)為(wei)固相抗(kang)體和酶(mei)標(biao)抗(kang)體，則在(zai)測定(ding)時(shi)(shi)可使標(biao)本的(de)(de)加入和酶(mei)標(biao)抗(kang)體的(de)(de)加入兩步并作(zuo)一步（圖15-5）。這種雙位點一步不(bu)但簡化了操作(zuo)，縮短(duan)了反應(ying)(ying)時(shi)(shi)間，如應(ying)(ying)用(yong)高親和力的(de)(de)單(dan)(dan)克(ke)隆抗(kang)體，測定(ding)的(de)(de)敏感性和特(te)異性也顯著提(ti)高。單(dan)(dan)克(ke)隆抗(kang)體的(de)(de)應(ying)(ying)用(yong)使測定(ding)抗(kang)原(yuan)(yuan)的(de)(de)ELISA提(ti)高到新(xin)水平(ping)。

　　在一(yi)步法測定(ding)中，應注意鉤(gou)(gou)狀效應（hookeffect），類同于沉(chen)淀反應中抗原(yuan)(yuan)過(guo)剩的后帶(dai)現象。當標(biao)本中待測抗原(yuan)(yuan)濃度相當高時，過(guo)量抗原(yuan)(yuan)分別和固相抗體及酶標(biao)抗體結(jie)合，而不再形成夾心復合物，所得結(jie)果將低于實(shi)際含量。鉤(gou)(gou)狀效應嚴(yan)重(zhong)時甚至可出現假陰性結(jie)果。

　　（三）間(jian)接法(fa)測抗體

　　間接法(fa)是(shi)檢(jian)測抗(kang)體最常用的方法(fa)，其原(yuan)理(li)為(wei)(wei)利用酶標記(ji)的抗(kang)抗(kang)體以(yi)檢(jian)測已與固相結(jie)合的受檢(jian)抗(kang)體，故稱為(wei)(wei)間接法(fa)。操作步(bu)驟如(ru)下：

　　（a）將特(te)異性抗(kang)原(yuan)(yuan)與固相載(zai)體(ti)連接，形成固相抗(kang)原(yuan)(yuan)：洗滌除去未結合的抗(kang)原(yuan)(yuan)及(ji)雜質。

　　（b）加稀(xi)釋的(de)受檢血(xue)清：其(qi)中(zhong)的(de)特異抗(kang)(kang)體與抗(kang)(kang)原結(jie)合(he)(he)，形成(cheng)固(gu)相抗(kang)(kang)原抗(kang)(kang)體復合(he)(he)物。經洗滌后，固(gu)相載(zai)體上只留下特異性抗(kang)(kang)體。其(qi)他免疫(yi)球蛋白及血(xue)清中(zhong)的(de)雜質由(you)于(yu)不(bu)能與固(gu)相抗(kang)(kang)原結(jie)合(he)(he)，在洗滌過程中(zhong)被洗去。

　　（c）加酶標(biao)抗抗體：與固相(xiang)復(fu)合物中的(de)抗體結合，從而(er)使該抗體間接地標(biao)記上酶。洗滌后，固相(xiang)載體上的(de)酶量(liang)就代表特異性抗體的(de)量(liang)。例(li)如欲測人對某(mou)種疾病的(de)抗體，可用酶標(biao)羊(yang)抗人IgG抗體。

　　（d）加底(di)物顯色：顏(yan)色深度(du)代(dai)表標本中受(shou)檢抗體的量。

　　本(ben)法只要更換(huan)不同的(de)固相抗原，可(ke)以用一種酶標抗抗體(ti)檢測(ce)各種與抗原相應的(de)抗體(ti)。

　　（四）競爭法

　　競爭法可用于測(ce)定(ding)抗原(yuan)，也(ye)可用于測(ce)定(ding)抗體。以測(ce)定(ding)抗原(yuan)為例(li)，受檢(jian)抗原(yuan)和酶標(biao)抗原(yuan)競爭與固相(xiang)抗體結合，因此結合于固相(xiang)的酶標(biao)抗原(yuan)量(liang)與受檢(jian)抗原(yuan)的量(liang)呈反比。操作步驟如下(xia)：

　　（a）將特異抗體(ti)與固相載體(ti)連接，形成(cheng)固相抗體(ti)。洗(xi)滌。

　　（b）待測(ce)管(guan)中(zhong)(zhong)加(jia)(jia)(jia)受檢(jian)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)本(ben)和一定量(liang)酶(mei)(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)的(de)(de)混合(he)溶液，使之與(yu)(yu)固相抗(kang)(kang)(kang)體(ti)反(fan)應。如受檢(jian)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)本(ben)中(zhong)(zhong)無抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)，則酶(mei)(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)能(neng)順(shun)利地與(yu)(yu)固相抗(kang)(kang)(kang)體(ti)結合(he)。如受檢(jian)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)本(ben)中(zhong)(zhong)含(han)有抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)，則與(yu)(yu)酶(mei)(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)以同樣的(de)(de)機會與(yu)(yu)固相抗(kang)(kang)(kang)體(ti)結合(he)，競爭性(xing)地占(zhan)去了(le)酶(mei)(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)與(yu)(yu)固相載體(ti)結合(he)的(de)(de)機會，使酶(mei)(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)與(yu)(yu)固相載體(ti)的(de)(de)結合(he)量(liang)減(jian)少(shao)。參考管(guan)中(zhong)(zhong)只加(jia)(jia)(jia)酶(mei)(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)，保溫后，酶(mei)(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)與(yu)(yu)固相抗(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)結合(he)可達最(zui)充分的(de)(de)量(liang)。洗滌。　　（3）加(jia)(jia)(jia)底物(wu)顯色(se)(se)：參考管(guan)中(zhong)(zhong)由于結合(he)的(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)最(zui)多(duo)，故顏(yan)(yan)(yan)色(se)(se)最(zui)深。參考管(guan)顏(yan)(yan)(yan)色(se)(se)深度與(yu)(yu)待測(ce)管(guan)顏(yan)(yan)(yan)色(se)(se)深度之差，代表受檢(jian)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)本(ben)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)的(de)(de)量(liang)。待測(ce)管(guan)顏(yan)(yan)(yan)色(se)(se)越淡(dan)，表示標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)本(ben)中(zhong)(zhong)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)含(han)量(liang)越多(duo)。

收起